細菌脂多糖處理對斑馬魚免疫球蛋白亞型表達水平的影響

王志平，胡慶玲，郝 轉

( 1. 渭南師范學院 陜西省河流濕地生態與環境重點實驗室，陜西 渭南 714099； 2. 陜西師范大學 生命科學學院， 陜西 西安710062 )

細菌脂多糖處理對斑馬魚免疫球蛋白亞型表達水平的影響

王志平1,2，胡慶玲1，郝 轉1

( 1. 渭南師范學院 陜西省河流濕地生態與環境重點實驗室，陜西 渭南 714099； 2. 陜西師范大學 生命科學學院， 陜西 西安710062 )

以20 μg/mL的細菌脂多糖溶液對斑馬魚進行浸泡處理24 h，用實時熒光定量PCR技術分析斑馬魚IgM、IgD和IgZ基因表達水平的變化。對照組斑馬魚中IgD和IgZ的表達水平相當，且均低于IgM，說明IgM可能具有更重要的生物學作用。細菌脂多糖處理后，斑馬魚3種Ig亞型的表達水平均表現出先升后降趨勢，而且均在12 h達到最高值。然而，IgM和IgZ的升高幅度顯著高于IgD，而且IgM和IgZ在處理24 h后表達水平仍然顯著高于對照組，說明IgM和IgZ在魚類病原防御中具有更重要的免疫作用。另外，IgM對細菌脂多糖處理的應答速度比IgZ更快，說明體液免疫系統能夠更快地對細菌脂多糖處理作出有效應答，而黏膜免疫系統則反應較慢。

斑馬魚；補體；細菌脂多糖處理；表達水平; 熒光定量PCR

免疫球蛋白(Ig)是適應性免疫系統的重要組成部分，在疾病與機體免疫中具有主要作用。目前，圍繞傳統模式動物人和鼠的免疫球蛋白已開展了大量研究，現已發現哺乳動物的免疫球蛋白主要有5種亞型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。相比之下，僅在斑馬魚(Daniorerio)[1-3]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[4-5]、鯉魚 (Cyprinuscarpio)[6-8]和少量其他魚類[9-11]中發現了3種Ig亞型，即IgD、IgM、IgZ，其中 IgZ被認為是硬骨魚特有的Ig亞型[2]。

斑馬魚個體小，易于養殖、觀察和操作，而且具有較完善的基因組信息和遺傳學操作技術，成為研究魚類免疫系統的新型模式生物[2,12]。Li等[13]曾研究了IgLC(Ig輕鏈恒定區)、mIg(膜結合IgM的μ鏈)、sIg(分泌型IgM的μ鏈)以及IgZ(ζ鏈恒定區)等基因在斑馬魚個體發育過程中的表達水平及其對細菌脂多糖(LPS)處理的應答，從而對斑馬魚適應性免疫系統的個體發育過程進行了分析。Zimmerman等[2]則設計了一系列適于定量PCR分析的Ig亞型重鏈基因引物并研究了3種Ig亞型重鏈基因在個體發育過程的表達模式，他們發現在斑馬魚個體發育過程中IgM 的表達水平高于IgD和IgZ，說明IgM在個體發育過程中可能具有更重要的生物學作用。有報道稱，哺乳動物不同Ig亞型的相對表達水平變化是機體免疫反應的重要標志之一[2]。本文采用實時定量PCR技術分析細菌脂多糖浸泡處理對斑馬魚不同Ig亞型基因表達水平的影響，旨在探討不同Ig亞型在魚類機體免疫中的功能差異。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚的飼養與處理

試驗用斑馬魚購自本地花鳥蟲魚市場，在大玻璃缸內馴化2周后用于試驗。缸內溫度為25～27 ℃，自然光周期并連續充氣，日投喂2次。取15尾健康斑馬魚放入質量濃度為20 μg/mL 的細菌脂多糖溶液中[13]，3、6、12、24 h后各取3尾，用于提取RNA以檢測基因表達水平。取3尾未進行處理的斑馬魚做對照。

1.2 RNA提取及cDNA制備

用DEPC水將斑馬魚洗3次，除去多余水分。加入液氮后迅速研磨，將組織粉末轉入離心管中并加入TRIZOL試劑(每0.1 g組織加1 mL)，充分振蕩搖勻后提取總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將總RNA用DNase Ⅰ(Promega)消化，以消除基因組污染。之后，用反轉錄試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。

為檢測反轉錄質量，以跨內含子的β-actin基因引物(上下游引物分別為5′-CTCCGGTATGTGCAAGGC-3′和5′-GCTGGGCTGTTGAAGGTC-3′)進行PCR擴增，并對擴增產物進行電泳檢測(長度應為354 bp)。若僅有特異性目的片段，說明無基因組污染，該模板cDNA可用于定量PCR分析；否則需對RNA進一步消化并重新反轉錄。

1.3 Real-time PCR分析

本試驗以β-actin基因作內參基因[14-16]。所有引物序列引自Zimmerman等[2]，引物序列及擴增子長度見表1。引物由上海生物工程有限公司合成，以無菌水溶解，稀釋至15 μmol/L。

表1 定量PCR分析中所用引物

按照SYBR GREEN Real-time PCR Master Mix(TAKARA)說明書在MiniOpticon PCR儀(伯樂)進行定量PCR擴增。每個反應3個重復，反應條件如下：

95℃3min1個循環95℃5s60℃15s72℃30s40個循環*熔解曲線分析

注：在每個循環的延伸階段收集熒光信號.

1.4 數據分析

定量PCR結束后，根據目的基因和β-actin的Ct值，采用相對Ct法(2-ΔΔCt)法計算不同Ig亞型的相對表達量[17]，其中ΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)，ΔΔCt=(ΔCt目的基因-ΔCtIgM對照組)。結果以對照組IgM的表達量作參照。之后，對上述數據進行單因素方差分析，P<0.05認為差異顯著。

2 結 果

電泳檢測發現斑馬魚總RNA比較完整(圖1)，以跨內含子的β-actin引物對cDNA模板進行PCR擴增后所得產物單一且大小合適(約354 bp)(圖2)，說明cDNA質量很好。另外，定量PCR的熔解曲線僅有一個峰，再次證明擴增的特異性。

圖1 斑馬魚總RNA的電泳檢測

圖2 斑馬魚反轉錄cDNA的β-actin擴增產物檢測

2.1 細菌脂多糖處理對斑馬魚IgM基因表達水平的影響

IgM通常是動物血液中含量最豐富的Ig亞型，主要功能是抑制、凝集、溶解入侵血液的細菌。以細菌脂多糖處理斑馬魚后，IgM的表達水平自6 h開始顯著升高(1.58)(P<0.05)，12 h達到峰值(2.51)，隨后開始降低，但24 h時其表達水平(2.05)仍然顯著高于對照組(1.00)(P<0.05)(圖3)。

圖3 細菌脂多糖處理對斑馬魚IgM基因表達水平的影響*表示與對照組差異顯著(P<0.05)，其他圖同.

2.2 細菌脂多糖處理對斑馬魚IgD基因表達水平的影響

IgD可在個體發育的任何時候產生，與B細胞分化和發生密切相關。對照組斑馬魚中IgD的表達水平僅為0.63，顯著低于IgM。IgD對細菌脂多糖處理的應答比較慢，直到12 h其表達水平才顯著升高(1.14)(P<0.05)，隨后其表達水平開始降低，24 h時降到與對照組相當的水平(0.57)(圖4)。

圖4 細菌脂多糖處理對斑馬魚IgD基因表達水平的影響

2.3 細菌脂多糖處理對斑馬魚IgZ基因表達水平的影響

IgZ可能與哺乳動物IgA存在一定的進化關系，主要參與黏膜免疫反應，而黏膜免疫系統是病原微生物入侵魚體的最初屏障。對照組斑馬魚中IgZ的表達水平(0.70)與IgD相當(圖5)。斑馬魚經細菌脂多糖處理后，IgZ的早期應答模式與IgD十分相似，均自12 h開始升高(1.80)，隨后逐漸降低，區別在于24 h時IgZ的表達水平(1.28)仍顯著高于對照組(P<0.05)。

3 討 論

與哺乳動物類似，魚類的Ig亞型在形態學、結構、基因型以及生理生化特征等方面存在諸多差異。目前，關于魚類3種Ig亞型功能差異的研究還很有限。

細菌脂多糖是構成革蘭氏陰性菌細胞壁的一種脂多糖，能夠引起一系列的生物學效應，包括免疫刺激活性等。本文通過檢測Ig亞型對細菌脂多糖處理的應答方式來比較3種魚類Ig亞型的功能差異。研究表明，對照組斑馬魚中IgM的表達水平顯著高于IgD和IgZ，且后2種Ig亞型的表達水平相當，這與Zimmerman等[2]的研究基本相似。

Hu等[3,8]發現，細菌脂多糖刺激可引起斑馬魚IgZ和鯉魚IgT (IgZ同源物)的表達水平顯著升高。本文則進一步發現，以細菌脂多糖浸泡處理斑馬魚后，3種Ig亞型的表達水平均顯著升高，其中IgM 和IgZ 的上升幅度顯著高于IgD(3種亞型的基因表達最高值分別是對照組的2.51、2.57和1.81倍)，而且24 h時IgM 和IgZ的表達水平仍顯著高于對照組，進一步證明了IgM 和 IgZ 在抵抗病原入侵中具有更重要的免疫功能。

另外，從不同Ig亞型對細菌脂多糖處理的應答時間看，IgM的應答速度最快，其基因表達水平在6 h即顯著升高，而IgD和IgZ則從12 h開始升高。說明IgM參與的體液免疫系統能夠更快地對細菌脂多糖處理作出有效應答，相比之下，IgZ參與的黏膜免疫系統則反應較慢。

綜上，本文首次報道了低等脊椎動物斑馬魚受到細菌脂多糖處理后3種Ig亞型基因表達水平的變化。關于魚類3種Ig亞型的生物學功能和作用機制等尚需要深入研究，以進一步比較魚類和哺乳動物的免疫球蛋白差異并闡明免疫球蛋白從魚類向高等脊椎動物的進化過程。

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EffectofLipopolysaccharideTreatmentonExpressionofIgIsotypesInZebrafish

WANG Zhiping1,2, HU Qingling1, HAO Zhuan1

( 1. Key Laboratory for Ecology and Environment of River Wetlands in Shaanxi Province, Weinan Normal University, Weinan 714099, China; 2. Department of Life Science, Shaanxi Normal University, Weinan 710062, China )

The healthy zebrafish were immersed in 20 μg/mL LPS solution for 24 h, and the expressions of IgM, IgD and IgZ were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. In the control group, the expression levels of IgZ and IgD were similar, lower than that of IgM, indicating a possible heighted role for the IgM isotype. After LPS challenge, the expression of all Ig isotypes was significantly increased with a peak in 12 h. However, the increase range of IgM and IgZ significantly exceeded that of IgD, and their expression remained higher level than that in the control until 24h, indicating that IgM and IgZ played more important immunological role in response to antigen invasion. Moreover, IgM up-regulated its expression a bit more rapidly than IgZ did, hinting at the clue that the humoral immune system might respond to LPS challenge a bit faster than the mucosal immune system.

zebrafish; Ig isotype; LPS treatment; expression; real-time fluorescent quantitative PCR

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.0023

S917.4

A

1003-1111(2016)06-0731-04

2015-12-02；

2016-03-08.

國家自然科學基金(31000410)；渭南市科技局科研計劃項目(2015KYJ-2-5)；渭南師范學院學科建設項目(14TSXK05).

王志平(1978—)，女，副教授，博士；研究方向：魚類免疫學. Email：wzhp1978@126.com.