中段食管癌原發灶和轉移淋巴結中端粒酶表達水平及其相關性研究

張　云，張金嶺，殷忠美，王守峰

(1.山東大學附屬臨沂市人民醫院腫瘤科，山東 臨沂 276000；

2.山東醫學高等專科學校附屬醫院腫瘤科，山東 臨沂 276000)

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中段食管癌原發灶和轉移淋巴結中端粒酶表達水平及其相關性研究

張云1，張金嶺1，殷忠美2，王守峰1

(1.山東大學附屬臨沂市人民醫院腫瘤科，山東 臨沂 276000；

2.山東醫學高等專科學校附屬醫院腫瘤科，山東 臨沂 276000)

[摘要]目的利用分子生物學技術檢測中段食管癌原發灶和各組轉移淋巴結中端粒酶活性，探討轉移淋巴結與原發灶的相關性，為食管癌放療分子靶區勾畫和個體化精確放療提供新思路。方法利用TRAP銀染色法檢測端粒酶活性，采用χ2檢驗端粒酶活性表達強度與食管癌臨床病理間的關系，采用CMH χ2檢驗分析轉移淋巴結、正常黏膜組織中端粒酶活性的差異，采用Spearman相關系數法分析原發灶和各組轉移淋巴結端粒酶表達水平的相關性。結果150例食管癌中，端粒酶mRNA的陽性表達率為60.0%，各組轉移淋巴結中端粒酶mRNA的陽性表達率處于1.3%～64.4%之間，按照108、107、7、2、3、109(淋巴結組)的順序依次降低。結論端粒酶活性可以作為了解腫瘤的轉移能力和食管癌淋巴結微轉移的一個標志，可以為食管癌分子靶區的勾畫提供新依據。

[關鍵詞]食管癌；端粒酶；轉移淋巴結

人體絕大多數的惡性腫瘤細胞呈端粒酶陽性，而人體正常細胞(除人體生殖細胞、某些淋巴細胞和造血干細胞外)卻為陰性，提示端粒酶可成為惡性腫瘤的重要標志,且已有食管癌組織中的端粒酶活性明顯增加的報道[1-5]。端粒酶活性與腫瘤細胞惡性程度密切相關，是診斷多數惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標，因此本研究應用TRAP法檢測原發灶和轉移淋巴結中端粒酶活性表達水平及其相關性，為食管癌放療尋找精確靶區，提高患者生存率，以期為臨床應用打下堅實基礎。

1材料與方法

1.1材料選取2010年1月至2013年1月期間臨沂市人民醫院收治的中段食管癌且行手術切除治療患者150例，病理類型明確且有淋巴結轉移。取其術后原發病灶和轉移淋巴結標本，快速取材，液氮速凍后轉至-80 ℃低溫冰箱中貯存。取原發灶癌旁>5 cm食管黏膜標本作為對照。所有標本包埋切片8 μm左右，每份標本6張切片。

患者納入標準：1)無遠處轉移；2)術前未經放療或者化療；3)未侵犯心臟和氣管、支氣管。

1.2試劑TRAP-ezeTM端粒酶測定盒(美國Oncor公司)；GAPDH(內參基因)和telomere DNA(目標基因)由上海捷瑞生物公司合成。

1.3方法

1.3.1端粒酶提取每例標本取100 mg組織，用冷的wash buffer(10 mmol·L-1Hepes-KOH、1.5 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1DTT，pH 7.5)清洗后，置于90 mm組織研磨器中研磨成糊狀，轉至0.5 mL離心管中，低溫離心去上清后，立即加入200 μL預冷的Lysis buffer(10 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1MgCl2、1 mmol·L-1EDTA、0.1 mmol·L-1PMSF、5 mmol·L-1β-Mercaptoethanol、0.5% CHAPS、10% Glycerol)，混勻，冰浴勻漿物30 min后，4 ℃、16 000 r·min-1離心20 min，上清即所需提取液。

1.3.2端粒酶活性測定GAPDH(內參基因)：上游引物5’-CCCCACACACATGCACTTACC-3’；下游引物5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’。telomere DNA(目標基因)：上游引物5’-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGT-TTGGGTTTGGGTT-3’；下游引物5’-GGCTTGCCTTACCC-TTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3’。

1.3.3端粒酶活性檢測采用TRAP法檢測端粒酶活性。反應體系48 μL，含1 μL 50×dNTPs mix，1.0 μL Ts引物，1.0μL TRAP Primer mix，2 u taq酶，39.6 μL dH2O，加端粒酶提取液2 μL，加入2～3滴石蠟油后，轉至PCR擴增儀30 ℃延伸30 min后，馬上轉至94 ℃，然后進行PCR擴增，循環參數為94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共35個循環。每次檢測均設陽性對照與陰性對照，以三蒸水作為陰性對照，陽性對照試劑盒內已提供。反應結束后，取15 μL反應產物加5 μL上樣緩沖液經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳4～5 h，電壓125 V，電泳結束后，將凝膠置10%乙醇固定3 min，再用1%硝酸浸膠3 min后，0.2%硝酸銀染膠20 min后，在顯影液(80 mL H2O、20 mL Na2CO3、50 μL甲醛)中顯色至全部條帶顯色而背景不過高為止，再行10%冰乙酸固定3 min，將膠用保鮮膜包裹后作永久保存。在凝膠成像系統中照相后使用凝膠分析軟件進行結果分析。

1.4統計學處理利用SPSS 21.0分析數據結果，采用χ2檢驗分析端粒酶活性表達強度與食管癌臨床病理間的關系，采用CMHχ2檢驗分析轉移淋巴結、正常黏膜中端粒酶活性的差異，采用Spearman相關系數法分析原發灶和各組轉移淋巴結端粒酶表達水平的相關性，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1淋巴結轉移與食管癌臨床病理參數的關系食管癌淋巴結轉移與其腫瘤長度、分化程度以及腫瘤浸潤深度顯著有關(P<0.05)。見表1。

表1淋巴結轉移與食管癌臨床病理參數的關系

臨床病理參數淋巴結總數轉移淋巴結數目χ2P年齡/歲 <551632251 55～<6527306680.960.325 ≥651849332性別 男445810162.560.109 女1753225腫瘤長度/cm <42917536 4～<624534738.610.013 ≥61849443分化程度 高分化3163398 中分化14783257.610.020 低分化1570218腫瘤浸潤深度 T1～T225413208.250.004 T3～T43670921

2.2轉移淋巴結、正常食管黏膜組織中端粒酶的表達在150例食管癌中，各組轉移淋巴結中端粒酶mRNA的陽性表達率為1.3%～64.4%，按照108、7、107、2、3、109的順序依次降低。見表2。

表2　轉移淋巴結、正常食管黏膜組織中端粒酶的陽性表達率　%

2.3原發灶和各組轉移淋巴結端粒酶表達水平的相關性108、107、7、3組淋巴結與原發灶端粒酶表達有相關性，而2、109組淋巴結則與原發灶端粒酶表達無相關性。見表3。

表3原發灶和各組轉移淋巴結端粒酶表達水平的相關性

淋巴結組Prs1080.020.891070.010.8570.030.7530.040.7020.390.111090.580.32

3討論

食管癌是我國高發病之一，在致死性腫瘤中排第6位，年齡標準化發病率為每10萬人中19.7例[1]。其中，中段食管癌發病率最高，但是由于食管特殊的解剖結構，其極易發生淋巴結轉移。淋巴結轉移是影響食管癌患者整體生存率的重要因素，淋巴結轉移情況的精確評價影響腫瘤放療靶區的勾畫，而放療在食管癌中有非常重要的治療地位，因此精確的腫瘤放療靶區勾畫是延長總體生存率的基本保障[2]。精確的腫瘤放療靶區勾畫需要準確了解腫瘤轉移區域淋巴結的特點，但是一些早期微轉移灶難以通過內鏡以及影像檢查發現[3]，目前研究發現利用分子生物學評價腫瘤微轉移比病理學更精確。

端粒是真核細胞染色體末端的DNA-蛋白質復合物，其功能是穩定染色體末端，避免染色體重組和末端被降解，防止染色體復制時縮短，端粒合成有賴于端粒酶的參與。端粒酶是由RNA和蛋白質組成的核糖核蛋白，能識別特定的端粒重復序列，并以自身RNA部分為模板，合成新的端粒重復序列并添加到染色體末端，從而保持端粒的長度與染色體的穩定性，使細胞獲得永生化，甚至轉化為無限分裂增殖的腫瘤細胞[4]。研究[5]發現，人體絕大多數的惡性腫瘤細胞呈端粒酶陽性，而人體正常細胞(除人體生殖細胞、某些淋巴細胞和造血干細胞外)卻為陰性，提示端粒酶可成為惡性腫瘤的重要標志。Takubo等[6]檢測了31例食管癌，其端粒酶活性為87%(27/31)。趙春芳等[7]研究發現食管鱗癌組織內端粒酶陽性檢出率高達84.8%(28/33)，與肝細胞肝癌、前列腺癌、胃癌相近。近年來關于端粒酶和食管癌的研究熱點集中在兩者的關系上，研究[8]發現端粒酶與食管癌預后密切相關。Hsu等[9]認為端粒酶水平的變化是食管癌轉移和進展的重要機制和標志。Li等[10]也證明了端粒酶與食管癌的進展密切相關。總之，端粒酶活性與腫瘤細胞惡性程度密切相關，是診斷惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標，因此檢測食管癌原發灶和轉移淋巴結中端粒酶活性表達水平，了解各組淋巴結和原發病灶的相關性，是檢測腫瘤微轉移，優化食管癌放療靶區的新思路。

本研究結果顯示食管癌淋巴結轉移與性別、年齡無關(P>0.05)，而與腫瘤的長度、淋巴結轉移、分化程度以及腫瘤浸潤深度有關(P<0.05)與以往文獻[11]報道一致。

胸段食管癌患者長期生存率不高，主要是由于較高的淋巴結轉移發生率及局部復發率[12]。食管癌淋巴結轉移發生時間早，分布廣，可位于頸部和上腹部之間的任何區域。但各組淋巴結轉移風險以及與原發病灶的關系尚存在爭議，尤其在低分化癌、腺癌、小細胞癌等特殊病理類型中此問題尚不清楚。放療是食管癌特別是進展期食管癌的主要治療手段之一，是以食管癌各組淋巴結轉移率的規律而設計靶區的。由于食管癌壁內核食管周淋巴結管網豐富，并且疾病早期往往存在壁內浸潤和跳躍性轉移，目前檢查手段尚不能有效檢測出亞臨床病灶和微小轉移病灶，因而依據淋巴結轉移率的經驗而設計的靶區帶有一定程度的盲目性，各治療中心在設野及制定放療計劃時存在明顯差異，如何確定胸段食管癌淋巴結亞臨床病灶是放療的難點。本研究旨在通過檢測食管癌轉移淋巴結中端粒酶的活性，了解腫瘤微轉移，從而可以客觀和個體化評價食管癌各組淋巴結轉移情況。

基于本研究的結果，我們發現，食管癌轉移淋巴結中的端粒酶活性明顯高于周圍正常食管黏膜中的端粒酶活性(P<0.05)，說明通過檢測端粒酶活性了解淋巴結微轉移有可行性。通過利用相關性分析，我們進一步了解到108、107、7、3組淋巴結與原發灶端粒酶表達明顯相關(P<0.05)，這與我們既往基于病理結果大樣本的食管癌淋巴結轉移規律結果相似，從側面證實了通過檢測食管癌轉移淋巴結中端粒酶的活性了解腫瘤微轉移的可行性。而且108、107、7、3組淋巴結中端粒酶的活性逐漸減低，也與基于病理結果的食管癌淋巴結轉移規律結果相似，也說明了通過食管癌轉移淋巴結中端粒酶的活性了解各組淋巴結和食管癌原發病灶的關系有可行性。基于本研究結果，有望下一步大樣本的病例標本予以再次證實后，將試驗步驟和條件進行試劑盒研發，為臨床食管癌術后淋巴結微轉移的大規模檢測提供便利。

總之，從分子水平檢測中段食管癌原發灶以及淋巴結腫瘤微轉移，研究各組淋巴結轉移的規律，可以為食管癌放療分子靶區勾畫和個體化精確放療提供新思路。

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Expression of Telomerase in Primary Lesion and Metastatic Lymph Nodes of the Middle Esophageal Carcinoma and Their Correlation

Zhang Yun1,Zhang Jinling1,Yin Zhongmei2,Wang Shoufeng1

(1.DepartmentofOncology,theLinyiPeople’sHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Linyi276000,China;2.DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofShandongMedicalCollege,Linyi276000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the telomerase activity in the primary lesion and metastatic lymph nodes of the middle esophageal carcinoma and to explore the correlation between the lymph nodes and the primary lesion of tumor.To provide a new method identifying the molecular tumor area of individualized esophageal cancer radiotherapy.MethodsTRAP silver staining method was used to detect telomerase activity.Chi-squre test was used to explore the relation between the clinicpathological parameter and the lymph node metastasis.CMH Chi-squre was used to evaluate the difference of telomerase activity between the normal tissue and lymph node.Spearman Rank test was used to explore the relation between primary lesion and lymph nodes.ResultsIn the 150 cases of esophageal carcinoma,the positive expression rate of telomerase mRNA was 60.0%.The positive expression rate of telomerase mRNA in the lymph node stations was from 1.3% to 64.4%,and the decreased as the sequence of 108,107,7,2,3,109.ConclusionTelomerase activity can be used as a marker of tumor micro-metastasis and provide a new basis for the molecular target treatment of esophageal carcinoma.

[Key words]esophageal carcinoma; telomerase; lymph node metastasis

(收稿日期：2015-12-31)

[中圖分類號]R735.1；R730.23

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2016)02-0102-04

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2016.02.003

作者簡介：張云(1969-)，女，副主任醫師，主要從事食管癌的基礎與臨床研究。E-mail：zhangyunsdly@126.com。通信作者：張金嶺(1980-)，男，博士，主治醫師，主要從事食管癌的基礎與臨床研究。E-mail：jinlingzhang_931@163.com。