阿霉素腎病大鼠血清IL-17、IL-6的動態變化及其意義

張文曉，張碧麗

（1．天津醫科大學研究生院，天津300070；2．天津市兒童醫院腎臟科，天津300134）

論著

阿霉素腎病大鼠血清IL-17、IL-6的動態變化及其意義

張文曉1，張碧麗2

（1．天津醫科大學研究生院，天津300070；2．天津市兒童醫院腎臟科，天津300134）

目的：探究阿霉素腎病大鼠血清白細胞介素（IL）-17、IL-6的動態變化意義及潑尼松通過2種因子對阿霉素腎病的干預機制。方法：將81只大鼠隨機分為空白對照組、模型組、潑尼松干預組，每組27只，通過分次尾靜脈注射法建立阿霉素腎病大鼠模型，檢測4、6、8周末大鼠血生化、24 h尿蛋白定量及尿肌酐變化，計算內生肌酐清除率；應用ELISA檢測大鼠血清IL-17、IL-6水平的變化。結果：實驗第4周末，與空白對照組比較，模型組和潑尼松干預組大鼠出現大量蛋白尿、低白蛋白血癥和高脂血癥（P＜0．05），提示模型建立成功；模型組和潑尼松干預組大鼠血清IL-17、IL-6水平高于空白對照組。實驗第6、8周末，與模型組比較，潑尼松干預組24 h尿蛋白定量、血肌酐、總膽固醇顯著降低（P＜0．05），血清總蛋白、白蛋白、內生肌酐清除率顯著升高（P＜0．05）；潑尼松干預組大鼠血清IL-17、IL-6水平明顯低于模型組（P＜0．05）。結論：IL-17、IL-6參與了阿霉素腎病的免疫發病機制，潑尼松可能通過降低血清IL-17、IL-6水平參與阿霉素腎病的治療過程。

阿霉素腎病；腎病綜合征；Th17細胞；IL-17；IL-6；大鼠

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是一組以大量蛋白尿、低白蛋白血癥和高脂血癥為主要表現的臨床綜合征，目前已成為兒童最常見的腎臟疾病之一，但其發病機制至今尚未充分闡明。近幾十年，CD4+T細胞分泌紊亂在NS的免疫發病機制中的意義一直是學者們研究的重點，按產生的細胞因子不同，其亞群可分為Th1、Th2、Th17和調節性T細胞4種。既往實驗對NS發病機制的研究主要集中于Th1/Th2細胞失衡理論，然而其具體失衡方向卻一直頗受爭議[1-2]。自2005年Th17細胞作為一種獨立的Th細胞亞群提出[3]，大量學者將NS免疫發病機制的研究重點轉向Th17細胞及其相關細胞因子的分泌紊亂。IL-17是Th17細胞分泌的主要細胞因子，其血清水平主要受Th17細胞的影響，可以有效提示生物體內Th17細胞的分化情況。IL-6在Th17細胞的分化產生過程中發揮著重要作用，通過誘導某些特定因子的表達，促進初始CD4+T細胞向Th17細胞分化[4]。本實驗通過觀察阿霉素腎病大鼠血清IL-17、IL-6水平的動態變化及二者經潑尼松治療前后的改變，探討阿霉素腎病的免疫發病機制及潑尼松對其可能的干預機制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 注射用鹽酸多柔比星（阿霉素）10 mg/只，批號：130710，浙江海正藥業股份有限公司。醋酸潑尼松片5 mg/片，批號：130820，天津力生制藥股份有限公司。大鼠IL-17、IL-6 ELISA試劑盒，批號LOT201505，美國R＆D公司。金屬代謝籠由天津實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠81只，體質量180～200 g，鼠齡（40±5）d，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF級，許可證編號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與模型制造 81只大鼠適應性喂養7 d，將全部大鼠隨機分為空白對照組（A組）、模型組（B組）、潑尼松干預組（C組），每組27只。除A組外，其余兩組大鼠采用小劑量間隔1周2次尾靜脈注射阿霉素法造模，第1次注射0.1%阿霉素4 mg/kg，第2次注射3.5 mg/kg。A組大鼠尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。實驗第4周末，檢測各組大鼠血生化指標及24 h尿蛋白定量、尿肌酐，B、C組大鼠出現大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥，提示造模成功。實驗第5周開始每日晨起給予C組大鼠潑尼松水溶液灌胃1次，劑量為12.5 mg/（kg·d）[藥物等效劑量換算公式：大鼠劑量=折算系數（6.25）×人的劑量〈2 mg/(kg·d）〉]；A、B組大鼠予等劑量生理鹽水灌胃1次。給藥期間各組大鼠均自由攝取基礎飼料及進水。

1.2.2 觀測指標與檢驗方法 觀察大鼠一般情況：按時記錄大鼠體質量動態變化，觀察大鼠精神狀態、毛發色澤、活動及水腫情況。

實驗第4、6、8周末，將全部大鼠置于代謝籠禁食不禁水，收集24 h尿液，記錄24 h總尿量，檢測24 h尿蛋白定量、尿肌酐；每次留尿后每組隨機抽取9只處死，取血檢測血生化，包括血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、血清總蛋白（Tp）、血清白蛋白（Alb）、血清球蛋白（Glo）、血清總膽固醇（TCho），計算內生肌酐清除率（Ccr）[mL/(min·kg）]=[尿肌酐濃度（μmol/L）×每分鐘尿量（mL/min）]/[Scr濃度（μmol/L）×體質量（kg）]。

另留4、6、8周末處死大鼠血分離血清凍存，待實驗結束，用ELISA試劑盒分別檢測血清中IL-17、IL-6水平。具體步驟：準備試劑、樣品和標準品；加入準備好的樣品和標準品，37℃反應30 min；洗板5次，加入酶標試劑，37℃反應30 min；洗板5次，加入顯色液A、B，37℃反應10min；加入終止液，15min內讀OD值，根據OD值在標準曲線上查其濃度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。本研究數據屬于正態分布資料，實驗結果以s表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩組間比較，方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett T3法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察 A組大鼠一般狀況好，體質量增加（10±5）mg/d，色毛光澤，活動自如，未見水腫。B、C組大鼠在第2次阿霉素注射后開始出現進食減少，體質量減輕，至4周末可見色毛粗糙蓬松，觸之反應激烈，陰囊出現水腫；B組大鼠4周后，一般狀況持續較差，體質量未見上升，至6~8周出現四肢水腫，活動遲緩，還有多只出現腹水。C組大鼠4周后隨藥物干預治療，一般狀況逐漸改善，進食增多，體質量上升，陰囊水腫減輕，少見四肢水腫，無腹水出現。

2.2 各組大鼠血、尿生化指標檢測結果 見表1。

2.2.1 實驗第4周末血、尿生化指標檢測結果 實驗第4周末，B、C組大鼠24 h尿蛋白定量、SCr、TCho均明顯高于A組（P＜0.05），Tp、Alb、Ccr均明顯低于A組（P＜0.05），提示模型建立成功。

2.2.2 實驗第6周末血、尿生化指標檢測結果 實驗第6周末，C組大鼠24 h蛋白尿定量、SCr、TCho明顯低于B組（P＜0.05）,Tp、Alb、Ccr明顯高于B組（P＜0.05）；與4周末比較，B組大鼠24h蛋白尿定量、SCr、TCho升高（P＜0.05），C組降低（P＜0.05），B組大鼠Tp、Alb、Ccr降低（P＜0.05），C組升高（P＜0.05）。

2.2.3 實驗第8周末血、尿生化指標檢測結果 實驗第8周末，C組大鼠24 h蛋白尿定量、SCr、TCho顯著低于B組（P＜0.05）,Tp、Alb、Ccr顯著高于B組（P＜0.05）；與6周末比較，B組大鼠24 h蛋白尿定量、SCr、TCho進一步升高（P＜0.05），C組明顯降低（P＜0.05），B組大鼠Tp、Alb、Ccr進一步降低（P＜0.05），C組明顯升高（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠血清IL-17、IL-6水平 實驗第4周末，B、C組大鼠與A組比較，血清IL-17、IL-6水平顯著升高（P＜0.05）。實驗第6周末，C組大鼠血清IL-17、IL-6水平低于B組（P＜0.05）；與4周末比較，B組大鼠血清IL-17、IL-6水平升高（P＜0.05），C組降低（P＜0．05）。實驗第8周末，C組大鼠血清IL-17、IL-6水平低于B組（P＜0．05）；與6周末比較，B組大鼠血清IL-17、IL-6水平進一步升高（P＜0．05），C組降低（P＜0．05）。見表2。

表1 A組、B組、C組血、尿生化指標的動態變化（s）Tab 1 Blood and urine biochemical indexes of group A,group B and group C（s）

表1 A組、B組、C組血、尿生化指標的動態變化（s）Tab 1 Blood and urine biochemical indexes of group A,group B and group C（s）

與A組相比，aP＜0.05；與B組相比，bP＜0.05；dP＜0.05；與4周相比；eP＜0.05；與6周相比，fP＜0.05

?

表2 A組、B組、C組血清IL-17、IL-6水平（s）Tab 2 Serum IL-17,IL-6 levels of group A,group B and group C（s）

表2 A組、B組、C組血清IL-17、IL-6水平（s）Tab 2 Serum IL-17,IL-6 levels of group A,group B and group C（s）

與A組相比，aP＜0.05；與B組相比，bP＜0.05，dP＜0.05；與4周相比，eP＜0.05；與6周相比，fP＜0.05

?

3 討論

阿霉素腎病大鼠模型的主要表現及病理變化類似于人類NS，尤其是兒童最常見的微小病變型腎病（MCNS），目前已被國內外學者廣泛用于兒童NS的研究。本實驗采用2次尾靜脈注射法建立腎病模型，于實驗4周末出現大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥，提示模型建立成功。

大量研究證明，NS患兒體內存在細胞免疫失衡及細胞因子的分泌紊亂[5-6]。Th17細胞是一種重要的促炎細胞，在自身免疫性疾病和機體防御反應中具有重要的意義。Hünem?rder等[7]在2015年研究發現，在一些腎小球疾病中，腎組織Th17細胞表達增加，提示Th17細胞分化異常在腎臟疾病中發揮一定作用。IL-17是由Th17細胞分泌的特征性細胞因子，與Th17細胞的生物學效應關系最為密切，具有強烈的促炎作用可引起炎癥組織細胞浸潤和組織破壞[8]。此外也有研究證明，血清IL-17的異常分泌在多種自身免疫性疾病中扮演著重要角色[9-10]。Th17細胞的分化發育及分泌效應因子需要TGF-β、IL-6、IL-23等多種細胞因子共同參與，IL-6在此過程中發揮首要作用。IL-6在生物體內主要由活化的T細胞、成纖維細胞及一些抗原呈遞細胞分泌，是一種多效性前炎癥細胞因子，可與多種細胞因子共同作用于各種靶細胞，在許多炎癥性疾病中高表達。

IL-17和IL-6兩種細胞因子不僅在Th17細胞的分化過程中各自發揮作用，二者還存在一定關聯。IL-6可以通過誘導Th17細胞胞內特征性表達的轉錄因子孤獨受體γt(orphan nuclear receptor gamma t，RORγt)，促進CD4+細胞向Th17細胞的分化階段[11]，繼而分泌大量IL-17。IL-17又可以通過NF-κβ信號通路引發IL-6產生的正反饋環，促進IL-6的產生及相關炎癥反應。所以IL-6既是Th17細胞的上游調控因子，又是IL-17下游一個重要靶目標，二者相互影響與Th17細胞介導的免疫應答密切相關。在腎組織中，IL-17和IL-6的異常分泌均可參與腎小球的損害，促發蛋白尿的產生，從而加速NS的進展。IL-17能夠促進上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞等分泌大量趨化因子和細胞因子，這些因子可以集體動員、募集及活化中性粒細胞，促進大量炎癥細胞在腎組織聚集，破壞腎組織結構，導致腎小球濾過膜通透性增加，從而出現蛋白尿，腎功能不全等繼發改變。Wang等[12]在2013年研究發現在NS患兒外周血Th17細胞頻率和腎組織IL-17水平升高，推測Th17/IL-17及其相關因子對NS兒童腎組織產生一定的破壞，并參與蛋白尿的產生過程。IL-6在腎組織中由腎小球固有細胞如系膜細胞、內皮細胞、上皮細胞等分泌，其可通過自分泌和旁分泌的方式刺激系膜細胞增殖；同時，IL-6又可與其他細胞因子相互作用啟動或促進腎組織的炎癥和損傷，影響蛋白尿的產生發展以及腎臟病理改變，從而導致腎功能的降低[13]。2010年Wang等[14]研究發現在阿霉素腎病大鼠尿液和腎組織中IL-6水平均明顯升高，并且與24 h尿蛋白定量呈正相關，推測IL-6在MCNS的發病中起到一定的作用，但有關直接證據及具體機制尚需進一步研究。

在本研究中，實驗第4周末阿霉素腎病模型建立成功后，模型組及潑尼松干預組大鼠血清IL-17、IL-6水平明顯高于空白對照組，提示阿霉素腎病大鼠體內Th17細胞分化活躍，導致其主要細胞因子IL-17分泌增多，同時可以推測，Th17細胞及IL-17增多可能與其相關的前炎癥因子IL-6的過度釋放有關。另一方面，IL-17過度釋放也有可能進一步作用于其下游因子IL-6，激活其正反饋環，使其過度釋放。大量IL-17、IL-6可促進多種炎癥介質向腎臟募集，并與之共同作用于腎組織破壞其正常病理結構。在實驗第6、8周末，模型組大鼠24 h尿蛋白定量、SCr水平持續上升，說明大鼠阿霉素腎病較人體MCNS發展迅速，這與之前大量實驗的結果一致[15-16]，可能與大鼠和人類的異質性有關。同時，模型組大鼠血清IL-17、IL-6呈進行性升高，進一步說明IL-17、IL-6兩種因子參與了大鼠阿霉素腎病的發生、發展，阿霉素腎病大鼠體內有可能存在Th17細胞的過度分化，兩種因子的血清水平可以在一定程度上反映腎臟損害的程度。

另外，實驗第6、8周末，潑尼松干預組大鼠蛋白尿水平持續降低，且明顯低于模型組，提示大鼠經潑尼松治療病情有所好轉，潑尼松對阿霉素腎病起到一定治療作用。同時，其血清IL-17、IL-6水平持續下降，說明潑尼松可以下調阿霉素腎病大鼠血清IL-17、IL-6水平，抑制Th17細胞的過度分化。據此推測，潑尼松對阿霉素腎病的治療作用可能與其對兩種因子的調節及對Th17細胞的抑制有關。

綜上所述，該實驗證明阿霉素腎病大鼠體內存在IL-17、IL-6的分泌增加，也進一步證實Th17細胞的過度分化參與了阿霉素腎病的免疫發病過程。結合大鼠治療前后血清IL-17、IL-6水平及血、尿生化值改變，推測潑尼松對腎臟的保護作用可能與其對血清IL-17、IL-6水平的調節作用有關。臨床上還有待大量實驗來探究，控制血清IL-17、IL-6水平及糾正Th17細胞過度分化的干預手段是否可以對NS起到一定的治療作用，延緩NS的進程。

[1] Pan Q,Wu J,Tao J,et al.Role of basophils in the pathogenesis of minimal change nephrotic syndrome:A literature review[J].Exp Ther Med,2014，8(4):1027

[2] Prasada N,Jaiswala A K,Agarwalb V,et al．Differential alteration in peripheral T-regulatory and T-effector cells with change in P-glycoprotein expression in childhood nephrotic syndrome:A longitudinal study[J]．Cytokine，2015，72(2)：190

[3] Harrington L E,Hatton R D,Mangan P R，et al．Interleukin 17-p roducing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the Thelper type 1 and 2 lineages[J]．Nat Immunol，2005，6(11):1123

[4] Lin P.Targeting interleukin-6 for noninfectious uveitis[J].Clin Ophthalmol,2015,11(9):1697

[5] Youn Y S,Lim H H,Lee J H.The clinical characteristics of steroid responsive nephrotic syndrome of children according to the serum immunoglobulin E levels and cytokines[J].Yonsei Med J,2012,53 (4):715

[6] Valentin-Acevedo A,Covey L R,Gurkan S.B lymphocyte cytokine profile in a monozygotic twin pair discordant for nephrotic syndrome [J].Indian J Pediatr,2013,80(10):875

[7] Hünem ?rder S,Treder J,Ahrens S,et al.Th1 and Th17 cells promote crescent formation in experimental autoimmune glomerulonephritis[J].J Pathol,2015,237(1):62

[8] Wei P,Hu G H,Kang H Y,et al.An aryl hydrocarbon receptorligand acts on dendritic cells and T cells to suppress the Th17 response in allergic rhinitis patients[J].Lab Invest,2014，94(5):528

[9] Hreggvidsdottir H S,Noordenbos T,Baeten D L.Inflammatory pathways in spondyloarthritis[J]．Mol Immunol，2014，57(1):28

[10]Zheng L,Ye P,Liu C.The role of the IL-23/IL-17 axis inthe pathogenesis of Graves’disease[J].Endocr J,2013,60(5):591

[11]蓋豐豐，曹鵬，鮑浩，等.Th17細胞及相關細胞因子與腎臟疾病[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2012，21（2）：170

[12]Wang L,Li Q,Wang L,et al．The role of Th17/IL-17 in the pathogenesis of primary nephrotic syndrome in children[J]．Kidney Blood Press Res,2013,37（4/5）:332

[13]Savin V J,Sharma M,Zhou J,et al.Renal and hematological effects of CLCF-1,a B-cell-stimulating cytokine of the IL-6 family[J].J Immunol Res,2015,2015:714

[14]Wang L M，Chi Y J，Wang L N，et al．Expression of interleukin-6 in rat model of doxorubicin-induced nephropathy[J]．CJCP，2010，12 (11):912

[15]楊維娜，于琳華，郭尚溫，等.改良阿霉素腎病大鼠模型的建立[J].西安交通大學學報（醫學版），2009，30（4）：445

[16]王麗敏，鄧李玲，鄭嬋娟，等.白介素-18結合蛋白對阿霉素腎病大鼠Fractalkine表達的影響[J].臨床兒科雜志，2012，30（7）：666

（2015-11-20收稿）

Dynamic changes and significance of serum IL-17 and IL-6 in adriamycin-induced nephropathy rats

ZHANG Wen-xiao1，ZHANG Bi-li2
（1．Graduate School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2．Department of Nephrology，Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300134，China）

Objective：To explore the significance of dynamic change of serum interleukin(IL)-17,IL-6 in adriamycin(ADR)-induced nephropathy rats and the mechanism of prednisone intervention in ADR-induced nephropathy．Methods：Eighty-one rats were randomly divided into control group,model group,and prednisone intervention group．ADR model was induced by a tail intravenous injection of ADR twice．The blood biochemical indexes and 24 h urinary protein,urine creatinine were measured at the end of 4,6 and 8 weeks．The values of creatinine clearance(Ccr)were calculated by the formula．The expressions of serum IL-17 and IL-6 were detected by ELISA．Results：heavy proteinuria,hypoalbuminemia,hyperlipemia were measured in other groups at the end of 4 weeks compared with control group,indicating that the models were successfully established．The levels of IL-17 and IL-6 in model group and prednisone intervention group were higher than control group at the end of 4 weeks(P＜0．05)．At the end of 6 and 8 weeks,compared with model group,24 h proteinuria,urine creatinine,total cholesterol,serum creatinine,blood urea nitrogen in prednisone intervention group were decreased significantly(P＜0．05),while serum total protein,albumin,endogenous creatinine clearance rate were increased significantly(P＜0．05)．The expressions of serum IL-17 and IL-6 in prednisone intervention group were lower than control group(P＜0．05)．Conclusion：IL-17 and IL-6 may be involved in the immune pathogenesis of ADR-induced nephropathy rats．Prednisone could treat ADR-induced nephropathy by reducing the serum levels of IL-17 and IL-6．

adriamycin-induced nephrosis；nephrotic syndrome；Th17 cells；IL-17；IL-6;rat

R692

A

1006－8147（2016）03-0204-04

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目基金資助（13JCYBJC22300）

張文曉（1990-），女，碩士在讀，研究方向：兒科學；通信作者：張碧麗，E-mail：zhangbili218@163.com。