單增李斯特菌單克隆抗體的研制及特性分析

齊穎穎，　吳　萌，　王怡雯，　劉　慧，　謝遠紅，　張紅星*（.北京農學院食品科學與工程學院，北京006；.河北省生物研究所，河北石家莊05008）

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單增李斯特菌單克隆抗體的研制及特性分析

齊穎穎1，吳萌2，王怡雯1，劉慧1，謝遠紅1，張紅星*1
（1.北京農學院食品科學與工程學院，北京102206；2.河北省生物研究所，河北石家莊050081）

摘要：運用輻照法和熱滅菌法自制單增李斯特菌的免疫原、檢測原，運用尾靜脈免疫方法免疫BALB/c小鼠，運用雜交瘤技術進行細胞融合，制備得到抗單增李斯特菌的單克隆抗體，并對其進行免疫學特性分析。結果表明，成功篩選4株能穩定分泌抗單增李斯特菌的單克隆雜交瘤細胞株，腹水抗體效價為1∶102 400～1∶409 600，免疫球蛋白亞型為IgG1、Ig2a、Ig2b，親和力常數在1×107～1×1010L/mol；經測定分析出最佳配對抗體；并與綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌及大腸桿菌、沙門氏菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等菌屬無明顯交叉反應；進行雙抗體夾心ELISA方法對模擬單增李斯特菌污染肉樣檢測其靈敏度達1×103CFU/mL。獲得高效價、特異性強、靈敏度高的單克隆抗體，為食品中致病菌單增李斯特菌殘留的免疫學檢測方法奠定了基礎。

關鍵詞：單增李斯特菌；雜交瘤；單克隆抗體

民以食為天，食品安全關系到人類的生存和健康。隨著經濟全球化和食品貿易的日益擴大，危及人類健康、生命安全的重大食品安全事件屢屢發生，我國食品安全問題成為人們關注的熱點。危害食品安全物質[1]包括環境污染、化學性危害（抗生素、激素等）、微生物危害（生物毒素、致病菌等）。其中致病菌近幾年來給食品安全帶來很大的威脅，主要的致病菌包括沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特菌等等。

單核細胞增生李斯特菌[2]（Listeria monocytogenes，LM）簡稱單增李斯特菌，為革蘭氏陽性菌，需氧或兼性厭氧。LM是李斯特菌屬中最重要的人畜共患的食源性致病菌，被列為居沙門氏菌之后第二位主要的食源性致死病菌。單增李斯特菌中毒嚴重的可以引起血液和腦組織感染，被LM感染后死亡率可達30%，新生嬰幼兒和免疫力低下的人群中死亡率高達70%，常見病癥包括腦膜炎、腦脊髓炎以及孕婦流產等[3]。單增李斯特菌在2～42℃下生存，能在冰箱內生存較長時間，生存環境可塑性大，其在酸性、堿性條件下和高鹽濃度時也能存活并生長，適應范圍很大，帶菌較高的食品有乳制品、肉類等。單增李斯特菌不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，30%以上的肉制品均被該菌污染，約占85%-90%的病例是由于被該菌污染而引起[4]。

目前檢測單增李斯特菌有傳統分離鑒定方法、分子生物檢測法、免疫法[5]。其中傳統的分離鑒定方法操作過程耗費大量的時間和勞動力，分子檢測法的程序復雜、檢測儀器昂貴、檢測費用高。而免疫法應用抗原抗體的特異性識別作用，再通過酶催化底物的顯色反應，將結果顯示出來，具有快速、簡便、靈敏度高、結果準確、簡便等優點，適于大批量快速檢測的需要，成為目前致病菌檢測的主流技術，而基于該技術的快速檢測產品占有絕大部分市場。

1　材料與方法

1.1試驗動物

BALB/c小鼠：由北京實驗動物中心提供。

1.2主要試劑和儀器

單增李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC 54003、Listeria monocytogenes ATCC 54001，綿羊李斯特菌Listeria iuanuii ATCC 19119，英諾克李斯特菌Listeria innocua ATCC 33091，大腸桿菌E. coli O157 CMCC 44828，沙門氏菌Salmonella typhimurium ATCC13311，枯草桿菌Bacillus subtilis BD366，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC26003及鏈球菌Streptococcus thermophilus G1等標準株：作者所在實驗室保存。

小鼠SP2/0骨髓瘤細胞、單增李斯特菌免疫原和檢測原：北京農學院食品科學與工程學院保存和制備。

李斯特菌培養基（國標GB 4789. 30-2010）：北京陸橋技術有限責任公司。HAT培養基、HT培養基、PEG4000、完全佐劑和不完全佐劑以及小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒：Sigma公司；DMEM培養基、細胞培養板：GIBCO公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG：北京華美生科生物技術有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3動物免疫

選取8只6周雌性BALB /c小鼠，初次基礎免疫采用尾靜脈注射[6]30 μg自制免疫原；二次基礎免疫采用尾靜脈20 μg自制免疫原。免疫間隔為2周。內眥取血并分離血清，間接ELISA檢測小鼠血清抗體效價。選取最佳免疫小鼠，于融合前3天脾臟免疫注射免疫原20 μg加強免疫。

1.4雜交瘤細胞株的建立

取對數生長期的小鼠SP2/0骨髓瘤細胞與免疫脾細胞，按常規方法50% PEG進行細胞融合。檢測培養上清液抗體效價，選擇強陽性的細胞，從而進行數次有限稀釋亞克隆篩選培養，直至100%陽性。制備出穩定的分泌高特異性、高效價、高親和力抗體的雜交瘤細胞株，置于液氮中[7]。

1.5單克隆抗體的制備及抗體的特性分析

將抗單增李斯特菌雜交瘤細胞克隆及擴大培養接種于提前石蠟油致敏的雌性BALB/c小鼠腹腔[8]，誘生腹水產生抗單增李斯特菌單克隆抗體。7～10 d后收集3～9 mL腹水進行抗體的ProteinG純化[9]，采用SDS-PAGE法檢測抗體純度[10]，并用凝膠成像系統進行分析[11]；采用紫外吸收法測定抗體濃度。

采用間接ELISA法進行抗體效價測定；采用sigma公司抗體亞型檢測試劑盒鑒定抗體亞型。采用非競爭酶免疫試驗對單克隆抗體的親和力常數進行測定，采用高碘酸鈉的方法進行抗體標酶。

1.6 ELISA相加試驗及最佳配對

以單增李斯特菌自制檢測原包被酶標板，分別加入一株McAb腹水溫育后，再加入另一株McAbs腹水，溫育后加入酶標記山羊抗小鼠IgG抗體，以四甲基聯苯胺（TMB）為底物顯色，終止反應后測得OD值。McAbs最佳配對的選擇，按方陣交叉匹配法進行。分別以各種McAbs包被酶標板，以單增李斯特菌為中心抗原，和每種HRP標記的McAb逐一進行交叉匹配試驗[12]。

1.7抗體特異性[13]與敏感性檢測

用0.01 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液將單克隆抗體稀釋至5 μg/mL包被酶標板，4℃過夜；用PBS/T20洗板3次，每次3 min；用含10 %小牛血清的PBS/T20封閉，37℃孵育1 h，洗板；模擬污染肉樣37℃孵育45 min，洗板；加入另一單克隆抗體HRP酶標抗體37℃孵育30 min，洗板；加入TMB顯色液，37℃避光反應15 min后加入終止液；讀取波長450 nm的OD值[14]。

2　結果與分析

2.1抗單增李斯特菌雜交瘤細胞株的建立

進行細胞融合，每次用6塊96孔板，平均每孔有1～2株融合細胞生長，融合率為100 %。經過對陽性孔數次亞克隆，共獲得4株穩定分泌抗單增李斯特菌的雜交瘤細胞株。分別命名為：1B10、3A12、4G11、5F6。

2.2抗體的制備及純化

將得到的4株雜交瘤細胞分別注射到成年BALB/c小鼠腹腔內誘發腹水，每只獲取3～9 mL腹水。經間接ELISA檢測，4株腹水效價均在100 000以上。經蛋白質純化，蛋白質質量濃度為18.8～35.4 mg/mL，凝膠成像分析純度達88%～95%見表1。用Sigma公司的抗體亞型試劑盒鑒定，結果1B10為IgG2a，4G11為IgG2b，3A12和5F6為IgG1，見圖1。

表1　LM mAb的效價及純化后純度和蛋白質質量濃度Table 1　 Ascites titer and purity and purified protein content of anti-LM mAB

圖1　單克隆抗體亞型鑒定Fig. 1 Assay of monoclonal antibody subtype

2.3單克隆抗體識別抗原表位特性分析

為了測定單抗識別抗原表位的特性，先以棋盤法測定酶標記山羊抗小鼠IgG的飽和度，并測定抗原與McAbs的飽和濃度。在本試驗系統中，酶標記山羊抗小鼠IgG為1∶5 000倍稀釋，各株單抗腹水根據所測飽和濃度分別作1∶500～1∶2 000倍稀釋。結果以相加指數AI（addictivity index）大小來判定。

其中A1、A2分別是單獨使用一株McAb所測定的OD值，A1+2為兩株McAb所測定的OD值。若兩株McAbs識別抗原的同一表位，A1+2應等于A1和A2的均值，AI應為零；若兩株McAb識別不同的表位，A1+2應等于A1和A2的總和，AI則等于100%。在實際測定中，一般以AI值小于50%判定為識別相同的表位，以AI值大于50%判定為識別不同的表位。表2表明，只有1B10與4G11和3A12與5F6這兩對McAb互交相加后，AI值均小于50%（最高AI值只有15.29%），則兩對抗體所結合的表位是相同或距離很近，沒有互補或相加的特性。而其余兩對McAb互交相加后，計算得出的AI值大于50%（最高AI值為95.12%），具有相加性，它們識別抗原上不同的表位且表位的距離很遠，即認為是識別抗原上不同構象表位的。

2.4最佳配對的選擇及抗體靈敏度檢測

據相加試驗的結果，判定1B10與3A12，1B10 與5F6，4G11與3A12，4G11與5F5互為配對抗體。并將4株抗體分別標HRP酶為1B10-HRP，3A12-HRP，4G11-HRP和5F5-HRP。進行棋盤篩選試驗，取每一株抗體分別包被酶標板，與不同濃度模擬污染LM肉樣（107，106，105，104，103，100，50，10 CFU/ mg）反應后，加入各自其配對細胞株的標酶（HRP）抗體，其標酶抗體的初始質量濃度為2.5 μg/mL，按2n（n=0，1，2…）倍比稀釋加入，運用雙抗體夾心ELISA進行靈敏度檢測。經試驗證明1B10與3A12為最佳配對抗體，檢測LM的靈敏度是最高的，當1B10作為包被抗體，3A12作為酶標抗體其質量濃度為0.625 μg/mL時檢測LM的靈敏度可達100 CFU/mg，見圖2。

表2　4株McAb腹水相加試驗的OD值及AI值Table 2 Titer of the combined test value and AI by indirect ELISA

抗原分子上的表位是由線性的氨基酸殘基或者非連續序列折疊形成的緊密的三維結構，它們在抗原的表面是局部表面結構，1B10能與3A12-HRP配對檢測到LM，表明該抗原分子表面這兩個表位之間的距離較遠。采用兩株單抗夾心ELISA完成對LM的檢測，這樣既提高檢測靈敏度又能增強特異性，這是因為單抗是由單個雜交瘤克隆分泌的抗體組成的，具有均質性和很高的親和力，并且在抗原檢測上具有高度一致的特性。

圖2　1B10和3A12配對結果Fig. 2 Result of antibody pairs for ELISA

2.5雙抗夾心ELISA檢測特異性

以最佳配對的抗體以及最佳濃度來進行雙抗體夾心ELISA檢測特異性，其分別與兩株單增李斯特菌和綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌等菌株進行特異性檢測，見圖3。結果表明，兩個單克隆抗體夾心檢測的特異性很好，與兩株單增李斯特菌有明顯反應，但與綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌和空白對照沒有明顯交叉反應。

圖3　雙抗體夾心ELISA特異性測定Fig. 3 Assay of specificity by sandwich ELISA

2.6親和力測定

對4株單克隆抗體進行了親和力測定，結果見圖4。4株抗體的親和力為1×107～1×1010L/mol，其中，1B10的親和力是1×1010L/mol，3A12的親和力是1×1010L/mol。

圖4　親和力測定Fig. 4 Association constant（Kaffi）curve of LM mAb

3　結語

作者制備和選定的1B10和3A12兩株單克隆抗體效價高，抗單增李斯特菌特異性強，通過雙抗體夾心ELISA法可以實現對單增李斯特菌的免疫學檢測。這種檢測方法具有過程簡單、靈敏度高和分析速度快等優點，可作為對大量樣品的快速初篩選分析，再將疑似陽性樣品使用確證分析法進行確證，這樣可以降低大批量樣品的成本并提高分析效率。

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Preparation and Characterization of Monoclonal Antibodies Against Listeria monocytogenes

QI Yingying1，WU Meng2，WANG Yiwen1，LIU Hui1，XIE Yuanhong1，ZHANG Hongxing*1
（1. Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2. Biology Institute of Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081，China）

Abstract：In order to explore the specific monoclonal antibodies against Listeria monocytogenes for the immunological detection，irradiation life-style and thermal extinguishing method were used to produce Listeria nonocytogenes antibodies as the antigen，four hybridomas stably secreting McAbs to Listeria monocytogenes were developed. The results showed that fourhybridomas were successfully established，and the indirect ELISA titers of the ascites were 1：104～1：4×104. Their immune globulin subtypes were IgG1，Ig2a，Ig2b.Therefore，Listeria monocytogenes could be detected by a two-antibody-sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（das-ELISA）formed by McAbs. The affinity constants（Kaffi）were from 1×107L/mol to 1×1010L/mol，which had no cross-reaction between the other compounds. The sensitivity of LM McAbs in the detection of antigen was as low as 1×103CFU/mL. The high-titer，sensitive and specific anti-LM monoclonal antibodies were produced in thisstudy，whichmakesitpossibletodevelopimmunoassayfordetectionofLMresidues．

Keywords：Listeria monocytogenes，hybridomas，monoclonal antibody

*通信作者：張紅星（1970—），男，黑龍江哈爾濱人，工學博士，教授，碩士研究生導師，主要從事食品安全檢測方面的研究。E-mail：hxzhang511@163.com

基金項目：國家863科技計劃項目（SS2012AA101606-5；2012BAD28B02-01）；北京市長城學者培養計劃項目（CIT&TCD20140315）。

收稿日期：2014-07-04

中圖分類號：F 407.82

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）02—0151—05