嗜鹽四聯球菌的分離及其精氨酸代謝

廖淡宜，　方　芳*，　陳　堅，　堵國成，　劉　龍（1．江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；3.江南大學食品安全與營養協同創新中心，江蘇無錫214122）

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嗜鹽四聯球菌的分離及其精氨酸代謝

廖淡宜1，2，3，方芳*1，2，3，陳堅1，2，3，堵國成1，2，劉龍1，2
（1．江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；3.江南大學食品安全與營養協同創新中心，江蘇無錫214122）

摘要：嗜鹽四聯球菌是存在于醬醪發酵中后期的嗜鹽乳酸菌，其代謝精氨酸的特性與氨基甲酸乙酯前體物瓜氨酸的積累存在密切關系。為了降低醬油發酵過程中氨基甲酸乙酯前體物瓜氨酸的積累，研究采用選擇性培養基以及groEL基因特異性對嗜鹽四聯球菌進行了分離和篩選，得到一株Tetragenococcus halophilus R23。對該菌株在不同培養溫度和鹽濃度下的精氨酸代謝特性進行了考察。結果表明：在30℃，180 g/L NaCl培養條件下，嗜鹽四聯球菌R23消耗精氨酸和瓜氨酸能力最強，消耗量分別為100.0%和64.3%。其中，代謝精氨酸的培養基中未檢測到瓜氨酸的積累。這一特性對降低醬油發酵過程中氨基甲酸乙酯前體物瓜氨酸的積累具有重要意義。

關鍵詞：嗜鹽四聯球菌；醬油；氨基甲酸乙酯；精氨酸；瓜氨酸

近年來，與我國傳統發酵食品相關的食品安全事件的不斷出現，引起了人們的廣泛關注。影響傳統食品安全最為重要的因素之一是由于各種發酵過程中含氮化合物的不完全代謝而生成的胺（氨）類物質，如氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC），生物胺等。其中，氨基甲酸乙酯是影響范圍最廣的一種。國際癌癥機構于2007年正式將氨基甲酸乙酯歸為2A類致癌物（具有潛在致癌性）[1]。它的存在嚴重影響了我國傳統發酵食品的安全性，使其出口貿易受到限制[2]。醬油是一種具有中國傳統特色的調味品，近年來卻檢測出EC，這引起了專家的重視。目前，國內關于醬油中EC的報道僅集中在檢測方法上[3-4]；已有研究表明瓜氨酸是醬油釀造中形成EC的主要前體物質之一，并認為瓜氨酸積累與醬油發酵過程中的乳酸菌的精氨酸脫亞氨基（Arginine deiminase pathway，ADI）途徑受到高鹽環境抑制相關[5]。ADI途徑中的3個關鍵酶分別是精氨酸脫亞氨酶、鳥氨酸氨甲?；D移酶、氨基甲酸激酶。分別催化精氨酸轉化成為瓜氨酸，瓜氨酸轉化為鳥氨酸[6]得到的產物再進一步分解產生ATP、CO2和NH3。

嗜鹽四聯球菌屬乳酸菌，以前被歸類為嗜鹽片球菌屬，現在已單列為四聯球菌屬，廣泛存在于如醬油、果醬等高鹽或高糖環境中[7-8]，是產生揮發性風味物質的主要微生物之一[9]。研究發現瓜氨酸主要是在醬醪生產前期積累，而嗜鹽四聯球菌主要存在于醬醪生產的中后期[5]，已報道的嗜鹽四聯球菌全基因數據顯示其具有完整的ADI代謝途徑。因此，研究嗜鹽四聯球菌代謝精氨酸的能力和是否積累瓜氨酸對研究醬油EC前體物質瓜氨酸的積累機制具有重要意義。

作者從醬醪中分離嗜鹽四聯球菌，研究其精氨酸、瓜氨酸代謝能力，成功篩選到一株能將精氨酸和瓜氨酸轉化為風味氨基酸鳥氨酸，且無瓜氨酸積累的嗜鹽四聯球菌，并初步研究了該菌的培養條件，為降低醬油中氨基甲酸乙酯的含量提供了一條有效途經。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源分離菌株的樣品取自我國南方某醬油廠發酵180 d的醬醪。

1.1.2培養基分離培養基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母膏5.0，檸檬酸氫二銨2.0，葡萄糖20.0，吐溫80 1.0，乙酸鈉5.0，三水合磷酸氫二鉀2.0，七水合硫酸鎂0.58，一水合硫酸錳0.25，瓊脂18.0，氯化鈉100.0，溴甲酚紫0.06，生醬油100.0，制霉菌素50 U/mL，pH 6.0；種子培養基：MRS液體培養基，氯化鈉100.0 g/L；精氨酸利用檢測培養基（g/L）：酵母膏5.0，牛肉膏5.0，胰蛋白胨5.0，氯化鈉180.0，葡萄糖0.5，吐溫80 1.0，七水合硫酸鎂0.2，一水合硫酸錳0.05，硫酸鐵0.4，檸檬酸三銨2.0，碳酸鈣0.1，吡哆醛-5-磷酸0.05，磷酸氫二鉀2.0，精氨酸5.0，pH 6.0[10]；瓜氨酸利用檢測培養基（g/L）：酵母膏5.0，牛肉膏5.0，胰蛋白胨5.0，氯化鈉180.0，葡萄糖0.5，吐溫80 1.0，七水合硫酸鎂0.2，一水合硫酸錳0.05，硫酸鐵0.4，檸檬酸三銨2.0，碳酸鈣0.1，吡哆醛-5-磷酸0.05，磷酸氫二鉀2.0，瓜氨酸3.0，pH 6.0[10]。

1.1.3主要試劑和儀器基因組提取試劑盒：E.Z. N.A Bacterial DNA Kit D3350-01：購自上海生物工程有限公司；MRS培養基：購自OXIOD公司；HPLC（安捷倫1200）：購自安捷倫科技公司；DNA maker：購自TaKaRa公司；PCR儀：購自美國Bio-Rad公司；厭氧培養箱：購于日本三洋公司。

1.2菌株分離

從發酵第180 d的醬醪中取樣，醬醪懸液經過梯度稀釋后涂布于分離平板上，30℃培養7 d。挑選表面光滑、不透明、乳白色小單菌落。將單菌落在斜面上劃線分離兩次后接單菌落到種子培養基中培養4 d，提取基因組，根據嗜鹽四聯球菌groEL基因序列，利用Primer軟件設計引物擴增groEL基因，引物序列如下：groELF：5’- CGTCGTTCAATGCTTA ATGG -3’；groELR：5’- TGCTGCCAGAAGAAACTT CA -3’

以嗜鹽四聯球菌基因組為模板，PCR擴增條件：95℃預變性5 min，30個循環，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1.3菌株種屬鑒定及電鏡樣品制備

將groEL基因擴增結果顯陽性的菌株進行劃線分離兩次后接單菌落到種子培養基中培養4 d，提取基因組，利用細菌16S rDNA基因通用引物進行PCR擴增16S rDNA全基因序列。引物序列如下：27F：5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’；1492R：5’- GGTTACCTTGTTACGACTT -3’

以嗜鹽四聯球菌基因組為模板，PCR擴增條件：95℃預變性5 min，30個循環，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1.5 min。得到的PCR產物送到上海生物工程有限公司測序，得到序列后通過NCBI數據庫比對分析，確定菌株種屬。

將培養好的菌體用2.5 g/dL戊二醛溶液固定，0.1 mol/L的磷酸緩沖液漂洗，滴樣在透射電鏡的3 mm銅網上，磷鎢酸染色后在透射電鏡下觀察菌株的形態。

1.4精氨酸、瓜氨酸代謝

將-80℃保藏的嗜鹽四聯球菌劃線復蘇兩次后挑單菌落接種于種子培養基中，30℃靜置培養3 d，取4 mL菌液離心10 min（4 000 r/min，4℃）。棄掉上清后加入1 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）懸浮菌體，離心10 min（4 000 r/min，4℃），棄掉上清，向離心管中加入4 mL氨基酸利用檢測培養基。30℃靜置培養5天，檢測精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量。

1.5氨基酸測定

取1 mL相應培養液，離心10 min（4 000 r/ min，4℃），取上清液。用體積分數5%的三氯乙酸以1∶5比例稀釋上清液，用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾取濾液。用高效液相色譜法（HPLC）測定樣品中精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量。測定條件：色譜柱ODS-2 HYPERSIL。流動相A相（1 L）：無水乙酸鈉5 g，四氫呋喃5 mL，三乙胺200 μL，pH為7.2。流動相B相（1 L）：無水乙酸鈉5 g，超純水200 mL，甲醇400 mL，乙腈400 mL，pH為7.2。檢測器為VWD紫外檢測器，檢測波長338 nm，柱溫40℃[11]。

1.6嗜鹽四聯球菌3 L發酵罐擴培

將-80℃保藏的嗜鹽四聯球菌劃線復蘇后挑單菌落接種于種子培養基活化兩次，以體積分數4%的接種量接種到3 L發酵罐中，發酵培養基：MRS，NaCl 100 g/L，pH 7.0。培養條件：轉速100 r/min，溫度30℃。發酵70 h，平均每6 h取樣測OD600、pH。

1.7嗜鹽四聯球菌低溫生長和精氨酸、瓜氨酸代謝

將-80℃保藏的嗜鹽四聯球菌劃線復蘇后挑單菌落接種于種子培養基中，30℃靜置培養3天，活菌計數為2.3×108CFU/mL，將其放入低溫（15～20℃）下每隔5 d更換一次培養基并進行活菌計數，同時以30℃作為對照，研究嗜鹽四聯球菌在低溫與常溫下生長情況。分別取置于低溫下培養5 d和20 d的菌液離心10 min（4 000 r/min，4℃）。棄掉上清后向菌體加入1 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）懸浮菌體，離心10 min（4 000 r/min，4℃），棄掉上清，向離心管中加入4 mL氨基酸利用檢測培養基。30℃靜置培養5 d，檢測精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量。

2　結果與分析

2.1嗜鹽四聯球菌的分離與鑒定

熱休克蛋白GroEL是一種廣泛存在于細菌中的分子伴侶蛋白，其行使的功能相似，但不同物種間基因序列相差較大，因此本研究根據Tetragenococcus halophilus的groEL基因序列設計特異性引物，通過PCR擴增來篩選Tetragenococcus halophilus。挑選groEL基因擴增結果為陽性的菌株進行16S rDNA基因序列測定，將測得的16S rDNA全基因序列與NCBI GenBank中的數據比對，結果顯示與Tetragenococcus halophilus相似度大于99%的都是嗜鹽四聯球菌。用MEGA5.2.1軟件以Neighbor-Joining法（Bootstrap值設定為1000，其他值為軟件默認）構建系統發育樹，篩選到一株菌與Tetragenococcus halophilus NBRC 12172聚到了同一個分支，親緣關系最近。命名為Tetragenococcus halophilus R23。系統進化樹如圖1，Tetragenococcus halophilus R23電鏡圖如圖2。

2.2嗜鹽四聯球菌利用精氨酸能力分析

研究表明在醬醪發酵過程中，微生物通過精氨酸脫亞氨基途徑利用精氨酸轉化為瓜氨酸，造成瓜氨酸的積累[5]。為了考察嗜鹽四聯球菌代謝精氨酸的能力，將T. halophilus R23接種于精氨酸利用檢測培養基中培養，然后檢測精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸的含量，結果見表1。T. halophilus R23在低鹽條件下（100 g/L NaCl）利用精氨酸的量為5.0 g/L（利用率100.0%），高鹽條件下（180 g/L NaCl）利用精氨酸的量為4.88 g/L（利用率97.6%），低于低鹽條件下利用精氨酸的量，低鹽和高鹽條件下精氨酸轉換成鳥氨酸的轉化率分別為79.3%和92.9%，且均不積累瓜氨酸。

2.3嗜鹽四聯球菌利用瓜氨酸能力分析

瓜氨酸是醬醪發酵過程中形成氨基甲酸乙酯的主要前體物質之一，降低瓜氨酸的含量是減少氨基甲酸乙酯的有效措施之一。為了考察嗜鹽四聯球菌能否代謝瓜氨酸以及代謝能力，將T. halophilus R23接種于含有瓜氨酸的培養基中培養，然后檢測瓜氨酸和其終產物鳥氨酸的含量，結果見表2。T. halophilus R23在低鹽（100 g/L NaCl）和高鹽（180 g/ L NaCl）條件下用瓜氨酸的利用率64.3%和17.7%，說明T. halophilus R23對瓜氨酸具有一定的代謝能力。且在低鹽和高鹽條件下瓜氨酸轉換成鳥氨酸的轉化率均達到100%，這一特性對降低醬醪發酵過程中瓜氨酸的含量具有重要意義。

圖1　R23基于16S rDNA序列的系統發育分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of T. halophilus R23 based on its 16S rDNA sequence

圖2　T. halophilus R23電鏡圖Fig. 2 TEM observation of T. halophilus R23

表1　NaCl質量濃度對嗜鹽四聯球菌R23精氨酸代謝的影響Table 1　 Effect of salt on T. halophilus R23 arginine metabolism

表2　嗜鹽四聯球菌R23消耗瓜氨酸能力Table 2　 Detection of citrulline degradation by T. halophilus R23

2.4嗜鹽四聯球菌3 L發酵罐擴培

Natteewan等人已經采用添加嗜鹽四聯球菌作為一種工藝手段達到增加發酵食品風味的目的[8]。T. halophilus R23對培養條件要求較高，其生長受pH、溶氧、生長因子等限制。為獲得適合高濃度醬醪發酵的T. halophilus R23菌液并驗證擴培的可行性，將T. halophilus R23接種于合適的培養基進行純種培養，測定OD600生長曲線和pH變化曲線。T. halophilus R23單菌落經兩次搖瓶活化培養后接種于3 L發酵罐中擴大培養，生長曲線如圖3。如圖所示，0～8 h，菌生長處于延滯期，生長緩慢。8～30 h，菌體處于對數生長期，菌體大量繁殖，pH降低。30 h后菌體生長進入穩定期，此時菌體數目不再增加，pH也趨于穩定。35 h時檢測到最大A600 nm=3.21，活菌計數為3.2×108CFU/mL。

圖3　T. halophilus R23 3 L發酵罐擴培生長曲線Fig. 3 Growth curve of T. halophilus R23 cultivated in a 3 L fermentor

2.5嗜鹽四聯球菌低溫生長和精氨酸、瓜氨酸代謝

醬醪發酵前期控溫包括低溫（16℃）和常溫（30℃）兩個階段。為了研究溫度對T. halophilus R23生長和氨基酸代謝能力的影響，將T. halophilus R23在低溫和常溫下進行了連續培養，并測定了低溫培養（15～20℃）后T. halophilus R23對精氨酸和瓜氨酸的利用量。T. halophilus R23在低溫下隨著培養時間的延長，活菌數下降，在常溫下活菌數量隨著培養時間的延長先上升后下降，第10 d達到最大值，為3.0×108CFU/mL。兩個溫度下T. halophilus R23活菌數均在第25 d到1×106CFU/mL以下。將低溫培養一段時間后的T. halophilus R23接種于氨基酸利用檢測培養基中培養，然后檢測精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸的含量，結果見表3。低溫放置20 d 后T. halophilus R23利用精氨酸和瓜氨酸的能力仍然存在，但明顯低于低溫放置5 d后T. halophilus R23利用精氨酸和瓜氨酸的能力。

表3　低溫培養對嗜鹽四聯球菌R23利用精氨酸、瓜氨酸能力的影響Table 3　 Effect of cultivation of T. halophilus R23 on its degradation of arginine and citrulline at low temperature

圖4　T. halophilus R23不同溫度下生長曲線Fig. 4　 Growth curve of T. halophilus R23 cultivated at different temperature

3　結語

20世紀40年代，Nettleship實驗證明了氨基甲酸乙酯具有致癌作用[12]，隨后，在醬油等大豆發酵制品中檢測出了氨基甲酸乙酯。已有研究表明瓜氨酸是醬油發酵過程中形成氨基甲酸乙酯的主要前體物質之一，且溫度和鹽濃度等環境因素會影響乳酸菌的精氨酸脫亞氨基途徑，從而影響環境中瓜氨酸的含量[13]。

作者從我國南方某醬油廠發酵180 d的醬醪中篩選到一株嗜鹽四聯球菌株T. halophilus R23，通過對它在高鹽和低鹽條件下精氨酸和瓜氨酸代謝能力的考察，發現T. halophilus R23在高鹽環境中能將精氨酸和瓜氨酸轉化為鳥氨酸，不僅消耗了瓜氨酸，同時增加了風味氨基酸鳥氨酸，對醬醪發酵起到增香的效果。T. halophilus R23在高鹽條件下不積累瓜氨酸的特性與Pediococcus acidilactici在高鹽條件下代謝受到抑制不同[5]。為了得到適合高濃度醬醪發酵的T. halophilus R23菌體，本研究進行了3 L發酵罐擴培，發現T. halophilus R23延滯期較長。為了縮短發酵時間，下一步可以對T. halophilus R23進行發酵條件優化。作者考察了醬醪發酵的最適添加T. halophilus R23時期以及溫度對T. halophilus R23代謝精氨酸和瓜氨酸能力的影響，結合低溫處理菌體細胞研究了T. halophilus R23生長情況。發現低溫處理后的T. halophilus R23生長速率以及代謝能力下降。因此可以考慮在醬油發酵前期的常溫發酵階段添加T. halophilus R23來控制瓜氨酸的積累，從而達到降低醬油中氨基甲酸乙酯的目的。

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Isolation and Arginine Metabolism Detection of a Tetragenococcus halophilus Strain

LIAO Danyi1，2，3，FANG Fang*1，2，3，CHEN Jian1，2，3，DU Guocheng1，2，LIU Long1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3. Collaborative Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Wuxi 214122，China）

Abstract：The Tetragenococcus halophilus species is a halophilic lactic acid bacteria（LAB）exhibiting in the later fermentation of soy sauce moromi. The arginine metabolism of this species is closely related to the accumulation of citrulline which is the main ethyl carbamate precursor in soy sauce. A Tetragenococcus halophilus strain R23 was isolated from moromi by selective medium cultivation and PCR（targeting on the groEL gene）screening. The arginine metabolism of the strain was investigated under different cultivation temperature and salt concentration. A highest utilization of arginine and citrulline for T. halophilus R23 was observed at 30℃in the presence of 180 g/L NaCl，with degradation rate of 100.0% and 64.3%，respectively. In addition，there was no citrulline detected with in arginine consumption of R23，which provided a potential application of citrulline reduction in soy sauce during fermentation process.

Keywords：Tetragenococcus halophilus，soy sauce，ethyl carbamate，arginine，citrulline

*通信作者：方芳（1976—），女，安徽樅陽人，哲學博士，副教授，主要從事微生物與食品生物技術研究。E-mail：ffang@jiangnan.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金項目（3137821）；國家“973”計劃項目（2012CB720802）。

收稿日期：2014-11-24

中圖分類號：Q 93-3

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0048—06