高山被孢霉發酵生產花生四烯酸的優化

曹剛剛，　管政兵，　廖祥儒，　蔡宇杰*（.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫4；.江南大學生物工程學院，江蘇無錫4）

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高山被孢霉發酵生產花生四烯酸的優化

曹剛剛1，管政兵2，廖祥儒1，蔡宇杰*1
（1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

摘要：研究了高山被孢霉液態發酵產花生四烯酸過程中主要底物和培養條件對花生四烯酸產量的影響。采用單因素和正交試驗設計優化了碳源、氮源、無機鹽的種類及濃度，找出了最佳的培養溫度和變溫策略。試驗結果顯示最佳碳源和氮源及濃度是：玉米粉66 g/L，豆粕粉54 g/L；最佳無機鹽配方是：KH2PO43 g/L，MgSO41 g/L，Na2SO42 g/L。采取逐級變溫培養：30℃（3 d），25℃（4 d），20℃（4 d）。優化后生物量和花生四烯酸產量分別達到52.3和13.6 g/L。

關鍵詞：谷物粗粉；碳氮比；變溫策略；無機鹽；花生四烯酸；高山被孢霉

花生四烯酸即全順式Δ-5，8，11，14-二十碳四烯酸，縮寫為ARA。ARA是重要的人體生長發育必需的三大脂肪酸之一，在維持人體的健康和正常的生長發育中扮演重要的角色。作為多不飽和脂肪酸家族的重要一員，ARA是ω-6系列脂肪酸的代謝樞紐。ARA主要在以下兩個方面發揮它的生理功能：（1）結構組分。ARA是膜磷脂的組分之一，對于細胞的生長和分裂不可或缺。另外，其在人腦和視網膜等特殊結構中含量很高，對于智力和視力發育至關重要[1]；（2）調節功能。ARA能被人體吸收并轉化為多種二十碳衍生物，其中包括多種代謝調節物質，比如前列腺素、白細胞三烯和凝血噁烷等[2]，對于維持人體的內穩態具有重要作用[3]。另外，近年來的研究發現，ARA與信號傳導和癌癥的發生也有較為密切的關系[4-5]。目前，ARA在食品、水產養殖、醫藥和化妝品等領域都得到了廣泛的應用[6-8]。

ARA的傳統來源主要是植物草籽、動物肝臟和豬腎上腺等。但是這些來源一方面ARA含量很低，資源少，提取成本高昂，而且產量遠遠達不到市場需求。近年來實現的微生物發酵生產，相對而言優勢明顯：ARA含量高，大大降低了提取成本；發酵周期短，產量高；生產可操作性強，不受季節、氣候影響等[1，9]。

目前利用高山被孢霉已經實現了ARA的商業化生產，主要底物是葡萄糖、酵母粉等[10-11]，生產成本仍然較高，作者探索玉米和豆粕等生物質原料經生物轉化發酵生產ARA，并在此基礎上優化培養條件以期進一步提高轉化率和產量。

1　材料與方法

1.1菌種

高山被孢霉Mortierellaalpina，作者所在實驗室保藏。

1.2培養基

斜面培養基（g/L）：去皮馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20；種子培養基：玉米粉40 g/L，pH自然；發酵初始培養基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉5，KH2PO43，MgSO40.5，Na2SO41，CaCl20.5，pH自然。以上培養基均經過115℃滅菌20 min。

1.3方法

1.3.1菌絲和孢子懸液的制備斜面種子在25℃培養7 d至白色菌絲鋪滿斜面。加入5 mL無菌水用接種環刮下斜面表面菌絲和孢子，取出后置于三角瓶中用玻璃珠打碎，使得菌絲分散均勻。然后接入種子培養基。

1.3.2種子培養菌絲和孢子懸液按照體積分數10%的接種量接入種子培養基，30℃、200 r/min條件下培養36 h。

1.3.3搖瓶培養種子液以體積分數10%的接種量接入發酵生產培養基，200 r/min培養7 d。

1.3.4碳源和氮源優化分別以葡萄糖和酵母粉為碳源和氮源，研究不同氮源和碳源對菌絲生長和ARA產量的影響。

1.3.5 4種無機鹽質量濃度的優化玉米粉和豆粕粉作為碳源和氮源，按表1設計4因素三水平正交試驗。

表1　L9（34）正交優化設計因素水平表Table 1 Orthogonal design

1.3.6最佳培養溫度的確定發酵培養基接種后分別在20、25、30℃和分步降溫條件下培養13 d，并且每隔2 d測定生物量、總油脂和油脂組成。

1.3.7生物量的測定發酵結束后，用雙層紗布過濾發酵液，用去離子水洗滌菌體至濾液澄清。菌體70℃烘干至恒重。

1.3.8胞內油脂提取烘干后的菌體用研缽研磨成粉末，取0.5 g置于50 mL離心管中，加入2 mL去離子水和1.5 mL濃鹽酸，密封后80℃水浴消化1 h。細胞經消化裂解后用6 mL v（氯仿）∶v（甲醇）= 2∶1，分3次提取油脂。合并每次的氯仿抽提液，烘干揮發除去溶劑，稱重得油脂質量。

1.3.9脂肪酸組成分析取50 μL粗油脂加入50 mL離心管中，以2 mg十九烷酸作為內標，混合后加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液，70℃水浴保溫0.5 h；冷卻后再加入2 mL體積分數14%三氟化硼甲醇溶液，70℃水浴保溫0.5 h。脂肪酸甲酯化后加入6 mL正己烷和3 mL飽和氯化鈉溶液，震蕩后離心分層。上層正己烷用于氣相色譜檢測。

脂肪酸甲酯采用配備FID檢測器和EC-Wax （30 m×0.32 mm×0.25 μm）色譜柱的氣相色譜儀GC-9160進行分析。條件如下：載氣為氮氣，進樣量1 μL；進樣口和檢測器溫度分別設定為250和280℃；程序升溫：柱爐初始溫度120℃，保持3 min，然后以2℃/min升溫至160℃，再以4℃/min升溫至190℃。

2　結果與分析

2.1不同碳源的比較

碳源是影響微生物生長和產物形成最重要的因素之一。用于構成細胞和代謝產物的碳鏈支架。高山被孢霉胞內油脂的主要存在形式是甘油三酯[12-13]，主要元素即為碳。因此，要獲得生物量和油脂的高產就必須找到對生長和油脂積累最佳的碳源種類，并且供應量必須充足。

圖1顯示了使用不同碳源時的生物量、總油脂和ARA的產量。由圖可見，淀粉作為碳源時最有利于菌體的生長，以可溶性淀粉和玉米粉作為碳源時的生物量遠高于其它碳源。由于油脂是胞內產物，使用這兩種碳源也就得到了相對較高的總油脂和ARA產量。之前，國內外的相關研究普遍指出葡萄糖是高山被孢霉生長和產油的最佳碳源[11，14]，區別可能源于使用的菌株不同。另外，玉米磨粉直接用于高山被孢霉液態發酵生產ARA還沒有專門報道。由作者的研究結果可見，使用玉米粉作為碳源不僅可以大幅度降低原料成本，同時還可以獲得更高的產量。最高的生物量和ARA產量分別達到10.34、1.86 g/L，接近葡萄糖做碳源時的3倍。

圖1　不同碳源對于生長、總油脂和ARA產量的影響Fig. 1 Effect of different carbon sources on biomass，total lipids and ARA yield

2.2不同氮源的比較

氮源是又一決定產量的因素。作為氮源的營養物質主要為發酵體系提供氮元素。雖然氮并不直接參與ARA的元素組成，但是對于形成細胞成分的蛋白質及催化合成代謝產物的酶必不可少，因此間接影響了ARA產量。因為高生物量是高產的關鍵，因此，與碳源的優化相似，優良的氮源必須易于被菌體吸收同化并促進生長。

圖2顯示了不同氮源對于高山被孢霉生物量、總油脂和ARA產量的影響。總體上，高山被孢霉難于利用無機氮源而易于利用有機氮源。無機態氮作為唯一氮源時的生物量普遍極低，而有機氮源相反，尤其是豆粕粉，生物量達到14.45 g/L，相應的ARA產量達到了3.18 g/L。之前的研究者普遍報道酵母粉是ARA生產的最佳氮源[10，15]。作者的研究結果顯示高山被孢霉對于豆粕粉具有優良的利用能力。另外，豆粕本身油脂含量較高，能被細胞作為碳源利用，也可以作為多不飽和脂肪酸合成的前體[16]。因此，豆粕作為氮源時菌體的總油脂含量較其他有機氮源為高。

圖2　不同氮源對于生長、總油脂和ARA產量的影響Fig. 2　 Effect of different nitrogen sources on biomass，total lipids and ARA yield

2.3無機鹽的正交優化

KH2PO4，MgSO4，Na2SO4，CaCl2是已報道的對高山被孢霉發酵產ARA產量影響較大的4種無機鹽[17]。由于采用玉米粉和豆粕粉作為碳源和氮源，本身已經含有豐富的微量元素和生長因子，因此只選擇以上幾種優化濃度以提供充足的K、Na、Mg、Ca、P、S等元素。正交試驗設計及結果見表2。

由表所示極差計算結果可知各因素對于ARA的產量影響大小依次為CaCl2＞KH2PO4＞Na2SO4＞MgSO4。最佳組合為A2B3C3D1，最佳的無機鹽添加配方為（g/L）：KH2PO43，Na2SO42，MgSO41。其中MgSO4和Na2SO4質量濃度均是初始培養基的兩倍。在最佳添加量時ARA的產量比優化前有了較大幅度的提高。

2.4碳氮質量比的優化

Koike等[18]研究表明，碳氮質量比對于菌體的油脂含量影響明顯。低碳氮質量比時，氮源相對豐富，更有利于菌體的生長，此時菌體的總油脂質量濃度則相對偏低；反之，氮源相對匱乏，更有利于菌體的油脂積累，此時的生物量則相對偏低。為了獲得較高的ARA產量，需要找到最佳的碳氮質量比，使得生物量和油脂質量濃度得以平衡，從而獲得較高的總油脂產量。

表2　無機鹽優化L9（34）正交實驗數據和結果Table 2 Data and results of orthogonal design for optimization of mineral addition

圖3顯示了碳氮質量比在13～28范圍時生物量、菌體的油脂質量濃度和油脂中ARA質量濃度隨碳氮質量比改變的變化趨勢。隨碳氮質量比的升高，生物量逐漸減少；菌體的油脂質量濃度逐漸增大；而油脂中的ARA質量濃度則先升高后降低，在19時達到最大，達到34 g/dL。可見作者的研究結果與先前的報道相符。最佳碳氮質量比下ARA產量比初始碳氮質量比13時提高了17%。

圖3　碳氮質量比對生物量、菌體的油脂質量濃度以及油脂中ARA質量濃度的影響Fig. 3　 Effect of C/N ratio on biomass yield，lipids and ARA content

在以上優化的基礎上，把碳源和氮源質量濃度均提高3倍，在同樣的發酵時間和發酵條件下，生物量、總油脂和ARA產量分別達到45.1、21.8、8.7 g/L。

2.5溫度對生長及ARA產量的影響

溫度從多個方面影響ARA的生產效率。溫度偏低，菌體生長和分裂緩慢，造成遲滯期和對數期延長，延長了發酵周期，但是ARA含量高；溫度偏高，雖然可以快速進入穩定期，但是ARA含量減少。因為在低溫條件下菌體需要合成更多的多不飽和脂肪酸以維持細胞膜的流動性[19]。

不同溫度下生物量、總油脂和ARA產量列于表3中。隨著溫度的升高，達到穩定期所需的時間縮短。20℃時，第7天生物量才達到最大值；而在30℃時只需要3天生物量即達到最大值。但是，較低的溫度能得到更高的生物量（圖4）。不同溫度下菌體的油脂含量差別相對較小。油脂中ARA質量濃度也取決于溫度，20℃、13 d時，ARA達到了總油脂的57%，比30℃時高了17%。總體上，20℃時ARA產量最高，發酵13 d達到13.4 g/L。但是過長的發酵時間降低了生產效率。為了縮短發酵周期，采取逐級降溫的策略。如圖4所示，即30℃培養3 d，降溫到25℃培養4 d，最后降溫到20℃再培養4 d。此時的生物量和ARA的產量達到了20℃的水平，發酵時間縮短了2 d，提高了經濟效益。變溫培養時的生物量、總油脂和ARA產量隨時間的變化列于表3中。

表3　延長發酵時間時不同溫度及變溫條件下的生物量、總油脂和ARA產量比較Table 3　 Culture profiles of M. alpina grown at constant and stepwise temperature decreasing strategy associated with prolonged incubation time

圖4　不同溫度下生物量隨時間的變化Fig. 4　 Time courses of M. alpina under different temperatures

3　結語

作者通過優化高山被孢霉發酵產花生四烯酸的培養基組分和培養條件，發現碳源、氮源、無機鹽和溫度都對產量有重要影響。前兩者主要影響生物量，溫度則影響生物量和總油脂中的ARA產量。研究得出培養基最佳組成為：玉米粉66 g/L，豆粕粉54 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41 g/L，Na2SO42 g/L。采用玉米粉和豆粕粉等作為原料，可降低生產成本，變溫培養可以在不減少產量的同時縮短發酵時間。

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Optimization for the Production of Arachidonic Acid from Mortierellaalpina

CAO Ganggang1，GUAN Zhengbing2，LIAO Xiangru1，CAI Yujie*1
（1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：Single factor and orthogonal experiments were applied to investigate effects of different nutrients and conditions on the fermentation of arachidonic acid by M. alpina. Results indicated that corn and soybean meal were preferred for fungal growth and lipid accumulation. With a temperature-shift strategy the fermentation time was shortened two days. Arachidonic acid reached the maximum yield（13.6 g/L）when the medium was comprised of 66 g/L corn meal，54 g/L soybean meal，3 g/L KH2PO4，1 g/L MgSO4and 2 g/L Na2SO4.

Keywords：raw crop materials，C/N ratio，temperature-shift strategy，arachidonic acid，Mortierella alpina

*通信作者：蔡宇杰（1973—），男，江蘇無錫人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事生物工程研究。E-mail：yjcai@jiangnan.edu.cn

收稿日期：2014-08-21

中圖分類號：Q 815

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0101—06