呫噸酮衍生物XP—15對(duì)BEL—7402細(xì)胞線粒體膜電位的影響

陳毅飛　胡龍美　張楠　梁祖鵬　戴支凱

【摘 要】目的：探討呫噸酮并吡啶衍生物9-（2-嗎啡啉乙酰胺基）-7H-吡啶并[4，3-c]呫噸-7-酮（XP-15）對(duì)BEL-7402細(xì)胞線粒體膜電位的影響。方法：通過(guò)MTT法、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和克隆實(shí)驗(yàn)觀察XP-15對(duì)BEL-7402細(xì)胞增殖的影響；用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體膜電位的影響。結(jié)果：高劑量的XP-15能明顯抑制BEL-7402細(xì)胞增殖（P<0.05）；對(duì)BEL-7402細(xì)胞克隆的抑制作用，呈劑量和時(shí)間依賴性。XP-15作用后，BEL-7402細(xì)胞的線粒體膜電位降低（P<0.05）。結(jié)論：XP-15誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡的作用，可能與其降低線粒體膜電位有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】9-（2-嗎啡啉乙酰胺基）-7H-吡啶并[4，3-c]呫噸-7-酮；人肝癌BEL-7402細(xì)胞；線粒體膜電位

Effect of xanthono-pyridine derivative XP-15 on Human Gastric Carcinoma BEL-7402 cells

CHEN Yi-fei1 HU Long-mei2 ZHANG Nan2 LIANG Zu-peng2 DAI Zhi-kai1

（1.Department of Pharmacology， Pharmaceutical Institute of Guilin Medical College， Guilin Guangxi 541004， China；

2.Department of Pharmacology， Guilin Medical College， Guilin Guangxi 541004， China）

【Abstract】Objective： To investigate mitochondria membrane potential effect of a new xanthono-pyridine derivative 2-morpholino-N-（7-oxo-7H-chromeno[3，2-h]quinolin-9-yl）acetamide（XP-15）on Human Gastric Carcinoma cell line BEL-7402. Methods： Antiproliferative effect of XP-15 on BEL-7402 cells was evaluated by MTT assay， morphological examination and colonial assay. Intracellular mitochondria membrane potential were detected by fluorospectrophotometer. Results： XP-15 could inhibit proliferation of BEL-7402 cells in dose- and time-dependent manner（P<0.05）. After treated with XP-15， mitochondria membrane potential（P<0.05）of BEL-7402 cells were decreased. Conclusion： XP-15 inducing BEL-7402 cells apoptosis might be associated with decreasing mitochondria membrane potential.

【Key words】2-morpholino-N-（7-oxo-7H-chromeno[3，2-h]quinolin-9-yl）acetamide； Human hepatoma BEL-7402 cell line； Mitochondria membrane potential

以呫噸酮（xanthone，氧雜蒽酮） 為母體的化合物主要存在于藤黃科、遠(yuǎn)志科、桑科等植物中，是近代天然產(chǎn)物中一類重要的活性成分。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，含呫噸酮類化合物的藥材早已用于多種疾病的治療[1]。有研究結(jié)果顯示，呫噸酮類化合物具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗炎、降血壓、抗氧化、抗血栓形成、抗HIV-1及延緩神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進(jìn)程等活性[2]。腫瘤是臨床上的常見(jiàn)病、多發(fā)病，目前臨床治療效果尚不理想。呫噸酮類化合物的抗腫瘤應(yīng)用前景，已引起了醫(yī)藥學(xué)界的關(guān)注，但相關(guān)研究較少[3-5]。因此，利用現(xiàn)代藥理學(xué)方法，從分離或合成的呫噸酮類化合物中篩選出具有活性的先導(dǎo)化合物，并采用化學(xué)修飾等手段，使之成為廣譜、高靶向、低毒的抗腫瘤藥物，已成為呫噸酮類化合物抗腫瘤研究的當(dāng)務(wù)之急[6]。我們合成了呫噸酮衍生物9-（2-嗎啡啉乙酰胺基）-7H-吡啶并[4，3-c]呫噸-7-酮[2-morpholino-N-（7-oxo-7H-chromeno[3，2-h]quinolin-9-yl）acetamide）， XP-15][7]。本研究以人肝癌細(xì)胞株BEL-7402為對(duì)象，初步探索了XP-15抗腫瘤的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法[8]

1.1 材料

人肝癌BEL-7402株由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品。5氟尿嘧啶（FU）購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限責(zé)任公司。Trizol Regent和Prime ScriptTM RT reagent kit：寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、Fura-2/AM、Hoechest33258、羅丹明123（R123）和碘化丙啶（PI）均為Sigma公司產(chǎn)品； POWER SYBR？誖GREEN PCR Master Mix：Applied Biosystems，F(xiàn)oster City， CA。550型酶標(biāo)儀：BioTek Instruments， Inc. USA；DM4000b型熒光顯微鏡：Leica Microsystems Ltd.， Germany；TU1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：熒光分光光度計(jì)：Cary Eclipse，Australia；北京普析儀器有限責(zé)任公司；iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System：BioRad Laboratories， Inc.，USA；Mastercycler Gradient Cycler：Eppendorf AG，Germany。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將BEL-7402細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法與培養(yǎng)細(xì)胞的觀察

5×104·mL-1的BEL-7402細(xì)胞接種于96孔板，每孔180μL，分為空白對(duì)照組（Control，RPMI 1640）、陽(yáng)性對(duì)照組（FU，100μmol/L，RPMI 1640配制）和5個(gè)10倍梯度的試藥組（0.01-100μmol/L，RPMI 1640配制），每組設(shè)4個(gè)平行孔。在結(jié)束培養(yǎng)（24h、48h和72h）前4h，加入5 g/L的MTT。結(jié)束培養(yǎng)后，棄上清液，每孔加入150μL DMSO，37℃孵育15min，用酶標(biāo)儀在490 nm檢測(cè)各孔的吸光值（absorbance value，A value）。計(jì)算細(xì)胞存活率。重復(fù)3次。同時(shí)，倒置顯微鏡下觀察藥物作用72h后的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 細(xì)胞克隆

用細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)XP-15對(duì)BEL-7402細(xì)胞的長(zhǎng)期毒性作用。將指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在6孔板，每孔400個(gè)細(xì)胞。次日，分組給藥，24h后，換成無(wú)藥的完全培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d后，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)（每個(gè)集落的細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞）。計(jì)算各給藥組的克隆百分比，克隆百分比=給藥組的克隆數(shù)/陰性對(duì)照組的克隆數(shù)×100%。

1.2.4 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential， Δψm） 測(cè)定

膜通透性的陽(yáng)離子熒光染料R123可擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，聚集于帶負(fù)電位的線粒體，結(jié)合基質(zhì)蛋白后其熒光即淬滅。線粒體膜去極化時(shí)，R123釋放進(jìn)入細(xì)胞漿，R123熒光恢復(fù)。因此，R123熒光強(qiáng)度能反映線粒體膜去極化程度[10]。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入500 nmol/L的R123、37°C避光負(fù)載30 min后，D-Hanks洗3遍，再用D-Hanks液重懸細(xì)胞至4×105·mL-1。熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm）。熒光強(qiáng)度穩(wěn)定后，加入XP-15。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用給藥前的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 XP-15對(duì)BEL-7402細(xì)胞體外增殖的影響

XP-15作用BEL-7402細(xì)胞72 h的后（見(jiàn)圖1），空白組組細(xì)胞形態(tài)清晰，密度高。與空白組比，XP-15 100μmol/L劑量組出現(xiàn)細(xì)胞碎片，可見(jiàn)貼壁或懸浮的體積縮小的圓形細(xì)胞。MTT檢測(cè)顯示（圖2A），隨給藥劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，BEL-7402細(xì)胞的存活率逐漸降低。細(xì)胞克隆檢測(cè)顯示（圖2B），隨XP-15劑量的增加，BEL-7402細(xì)胞克隆數(shù)逐漸減少，其中，XP-15的10μmol/L和100μmol/L組的克隆形成率顯著降低。

2.2 Δψm的測(cè)定

R123熒光強(qiáng)度檢測(cè)顯示（圖3），隨XP-15劑量的增加，R123熒光強(qiáng)度逐漸下降。空白對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度（a.u.）為20.33±0.25，10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的XP-15作用后的平均熒光強(qiáng)度分別為20.31±0.36（P>0.05）、20.21±0.52和19.86±0.86，均低于空白對(duì)照組（P<0.05）。

3 討論

呫噸酮類化合物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞增殖周期和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性等生物學(xué)活性，在治療腫瘤方面極具前景[3，6]。為尋找抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物，我們合成了呫噸酮并吡啶衍生物XP-15[7]。結(jié)果顯示，100μmol/L 的XP-15對(duì)BEL-7402細(xì)胞增殖的抑制作用明顯。隨XP-15劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，10μmol/L和100μmol/L的XP-15對(duì)BEL-7402細(xì)胞克隆的抑制作用明顯。以上研究結(jié)果提示，XP-15能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制BEL-7402細(xì)胞的增殖。

線粒體功能紊亂也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。線粒體膜通透性增加時(shí)，可引起線粒體膜電位下降，繼而促凋亡因子（如Bad等）的釋放、細(xì)胞氧化或磷酸化功能障礙，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。本研究的結(jié)果顯示，XP-15可以劑量依賴性地降低線粒體膜電位，表明XP-15誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞的凋亡可能與其降低線粒體膜電位有關(guān)。

綜上所述，XP-15能誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡的作用，可能與其線粒體膜電位， XP-15抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編輯：楊玉潔]