血清B細(xì)胞刺激因子及C3d結(jié)合型供者特異性抗體在腎移植術(shù)后慢性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)中的診斷價(jià)值

范博涵 楊曉勇 錢小松 張希諾 劉航 王瑋 胡小鵬 張小東

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·論著·

血清B細(xì)胞刺激因子及C3d結(jié)合型供者特異性抗體在腎移植術(shù)后慢性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)中的診斷價(jià)值

范博涵 楊曉勇 錢小松 張希諾 劉航 王瑋 胡小鵬 張小東

目的 觀察血清B細(xì)胞刺激因子(BAFF)與C3d結(jié)合型供者特異性抗體(DSA)在腎移植術(shù)后慢性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)(AMR)中的診斷價(jià)值。方法 回顧性分析2010年5月至2012年5月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院行同種異體腎移植術(shù)的109例受者資料，觀察術(shù)后3年慢性AMR發(fā)生情況。病理診斷為慢性AMR的患者，留取診斷時(shí)刻靜脈血5 mL；同時(shí)留取與慢性AMR患者同期行腎移植術(shù)、未發(fā)生慢性AMR的受者血樣。檢測血清BAFF值、群體反應(yīng)性抗體(PRA)和DSA，PRA強(qiáng)陽性和DSA陽性者檢測血清C3d結(jié)合型DSA。繪制BAFF和C3d結(jié)合型DSA受試者工作特征(ROC)曲線，計(jì)算靈敏度、特異度、約登指數(shù)及曲線下面積。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 109例腎移植受者中，共19例病理診斷為慢性AMR，血樣平均留取時(shí)間為術(shù)后(28±7)個(gè)月，同期手術(shù)且未出現(xiàn)慢性AMR的32例受者血樣留取時(shí)間為術(shù)后(27±5)個(gè)月。慢性AMR患者和同期手術(shù)的非慢性AMR患者DSA陽性比例、C3d結(jié)合型DSA陽性比例和BAFF值分別為52.6%(10/19)和15.6%(5/32)、26.3%(5/19)和3.1%(1/32)、(2 070±825)pg/mL和(790±293)pg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=43.59、6.18，t=23.745，P均<0.05)，PRA陽性比例兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清BAFF和C3d結(jié)合型DSA診斷慢性AMR的靈敏度、特異度、約登指數(shù)和ROC曲線下面積分別為83%和77%、79%和83%、0.62和0.60、0.78和0.79，ROC曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 血清BAFF和C3d結(jié)合型DSA對診斷腎移植術(shù)后慢性AMR有一定價(jià)值，可作為高危患者診斷慢性AMR的輔助手段。

腎移植； B細(xì)胞刺激因子； C3d； 供者特異性抗體； 抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)

腎移植已經(jīng)成為終末期腎病患者的重要治療方式[1]，這得益于對排斥反應(yīng)更好的控制、手術(shù)技術(shù)的提高、臨床管理以及對術(shù)后感染、腫瘤、心血管疾病等并發(fā)癥治療方法的改善。慢性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)(antibody mediated rejection，AMR)仍然是移植物遠(yuǎn)期存活的最大障礙[2]。預(yù)測慢性AMR的生物標(biāo)記對其早期診斷和治療顯得尤為重要。

有證據(jù)表明，B細(xì)胞在移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要的作用。B細(xì)胞活化因子(B cell activating factor，BAFF)是一種對B細(xì)胞生成、成熟以及活化具有重要作用的同型三聚體。急性實(shí)體移植器官衰竭患者的免疫組織化學(xué)標(biāo)本中可以看到與C4d相伴隨出現(xiàn)的BAFF沉積[3]；在發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的移植腎中，也可以看到BAFF信使RNA以及蛋白表達(dá)升高[4]。Banham等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在ABO血型不相容腎移植受者中，血清BAFF升高與AMR明顯相關(guān)，BAFF可能可以預(yù)測AMR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，中和AMR患者體內(nèi)BAFF可能成為值得探索的治療方法。

C3d是補(bǔ)體C3經(jīng)過經(jīng)典途徑、旁路途經(jīng)或甘露糖結(jié)合凝集素途經(jīng)活化裂解而來的最小片段，是補(bǔ)體活化的標(biāo)志，是連接天然免疫和獲得性免疫的重要蛋白質(zhì)分子。目前，已有一些研究將免疫組織化學(xué)C3d染色應(yīng)用于移植腎、心臟等體液排斥反應(yīng)的檢測[6-7]。本研究旨在觀察血清BAFF和C3d在慢性AMR中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2010年5月至2012年5月因終末期腎病于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院泌尿外科行同種異體腎移植的109例受者資料。男性72例，女性37例；平均年齡(42±11)歲(22～69歲)。原發(fā)病包括：慢性腎小球腎炎77例，糖尿病腎病9例，高血壓腎病2例，多囊腎11例，IgA腎病9例，外傷1例。103例受者為首次移植，6例為再次移植。全部供、受者ABO血型相符，術(shù)前群體反應(yīng)性抗體(panel reactive antibody，PRA)陰性，淋巴細(xì)胞毒交叉配合試驗(yàn)均為陰性。

109例受者術(shù)中均給予甲潑尼龍1 000 mg，術(shù)后500 mg/d連用3 d；術(shù)后采用環(huán)抱素/他克莫司+嗎替麥考酚酯+醋酸潑尼松三聯(lián)免疫抑制方案。他克莫司起始劑量為0.1 mg·kg-1·d-1，環(huán)孢素起始劑量為6.0 mg·kg-1·d-1，根據(jù)血藥濃度調(diào)整用量；嗎替麥考酚酯2 000 mg/d；醋酸潑尼松5～10 mg/d。出現(xiàn)病理診斷的急性排斥反應(yīng)則予以抗胸腺細(xì)胞球蛋白治療。

1.2 研究方法

所有受者均隨訪3年，觀察慢性AMR發(fā)生情況。病理診斷為慢性AMR的患者，留取診斷時(shí)刻靜脈血5 mL；同時(shí)留取與慢性AMR患者同期行腎移植術(shù)、未發(fā)生慢性AMR的受者血樣，檢測血清BAFF值、PRA和供者特異性抗體(donor specific antibody，DSA)，PRA強(qiáng)陽性及DSA陽性的患者同時(shí)檢測血清C3d結(jié)合型DSA。術(shù)后3年內(nèi)未出現(xiàn)慢性AMR的受者留取術(shù)后3年血樣，檢測血清BAFF值。

(1)血清BAFF值檢測：采用ELISA法進(jìn)行檢測(美國R&D Systems公司試劑盒)，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，正常參考值為850 pg/mL[8]。

(2)PRA檢測：采用LABScreen法(美國One Lambda公司)進(jìn)行檢測[9]。結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)表示，MFI>1 000為陽性，>8 000為強(qiáng)陽性。

(3)DSA檢測：采用Luminex?技術(shù)檢測特異性抗體。HLA-Ⅰ類抗體包括HLA-A、B、Cw特異性抗體，HLA-Ⅱ類抗體包括HLA-DRB1、DQB1、DPB1特異性抗體。結(jié)果以MFI表示，MFI>1 000為陽性。

(4)C3d結(jié)合型DSA檢測：采用Luminex?技術(shù)檢測PRA強(qiáng)陽性(調(diào)整的MFI>8 000)及DSA陽性(調(diào)整的MFI>3 000)患者血清C3d結(jié)合型DSA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

109例受者移植術(shù)后3年血清肌酐中位數(shù)為121 μmol/L(65～341 μmol/L)，血紅蛋白中位數(shù)為10.7 g/dL(7.7～14.7 g/dL)，平均血清BAFF值為(1 040±85)pg/mL。共19例患者病理診斷為慢性AMR，血樣平均留取時(shí)間為術(shù)后(28±7)個(gè)月(14～36個(gè)月)，同期行腎移植但未出現(xiàn)慢性AMR的32例受者血樣平均留取時(shí)間為術(shù)后(27±5)個(gè)月(16～36個(gè)月)。19例慢性AMR患者中，男性13例，女性6例，平均年齡(44±10)歲(28～58歲)；32例同期手術(shù)的非慢性AMR受者中，男性21例，女性11例，平均年齡(41±8)歲(23～55歲)。

共檢出20例PRA強(qiáng)陽性，15例DSA陽性。慢性AMR患者和同期手術(shù)的非慢性AMR受者的DSA陽性比例、C3d結(jié)合型DSA陽性比例和BAFF值分別為52.6%(10/19)和15.6%(5/32)、26.3%(5/19)和3.1%(1/32)、(2 070±825)pg/mL 和(790±293)pg/mL，兩組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=43.59、6.18，t=23.745，P均<0.05)；兩組PRA陽性比例分別為52.6%(10/19)和31.2%(10/32)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

以病理診斷的慢性AMR為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制ROC曲線。血清BAFF和C3d結(jié)合型DSA預(yù)測腎移植術(shù)后慢性AMR的診斷效能指標(biāo)見表1。血清BAFF和C3d結(jié)合型DSA ROC曲線見圖1，2。MedCalc軟件比較BAFF和C3d結(jié)合型DSA ROC曲線下面積，發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，二者診斷慢性AMR準(zhǔn)確性均較高。

表1 血清BAFF和C3d結(jié)合型DSA預(yù)測腎移植術(shù)后慢性AMR的診斷效能指標(biāo)

注： BAFF. B細(xì)胞活化因子；DSA. 供者特異性抗體；AMR. 抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)

3 討 論

BAFF是TNF家族成員，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和活化的T細(xì)胞，有促進(jìn)B細(xì)胞生成、存活以及成熟的作用[10-11]。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，提高BAFF表達(dá)可以提高B細(xì)胞活性及數(shù)量，同時(shí)增加血液中丙種球蛋白、致病性自身抗體水平以及狼瘡樣自身免疫疾病的發(fā)生率[12]。BAFF對移植物的負(fù)面影響主要通過3種BAFF受體起作用：激活劑和鈣調(diào)親環(huán)素配體相互作用分子、BAFF-R及B細(xì)胞成熟抗原，這些受體主要表達(dá)于包括漿細(xì)胞在內(nèi)的B細(xì)胞譜系。在小鼠心臟移植模型中，BAFF缺乏的受體小鼠，尤其是同時(shí)應(yīng)用CNI的受體小鼠存活時(shí)間更長[13]。小鼠胰島移植模型中，BAFF被單克隆抗體阻滯后，可以觀察到MHC不相容胰島移植體存活[14]。在發(fā)生急性排斥反應(yīng)的腎移植受者中，移植腎活檢免疫組織化學(xué)檢測可以看到BAFF伴隨C4d在移植腎中沉積[3]。亦有長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)，外周血BAFF陽性CD4 T細(xì)胞與移植腎失功相關(guān)[15]。提高BAFF信使RNA和蛋白表達(dá)增加了慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[16]。

當(dāng)異物進(jìn)入機(jī)體時(shí)，在體內(nèi)沒有相應(yīng)抗體的情況下，其自身及代謝產(chǎn)物，或非特異性免疫處理后的產(chǎn)物可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，補(bǔ)體激活的產(chǎn)物C3d與異物或抗原共價(jià)結(jié)合，通過CD21使B細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，起到連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁作用[17]。C3d的代謝速度慢，體內(nèi)活化產(chǎn)生的C3d不會很快被清除，檢測C3d對了解補(bǔ)體活性具有重要意義。在人體內(nèi)，除小部分C3d與免疫復(fù)合物或抗原結(jié)合外，大部分游離在體液中，并進(jìn)入血液循環(huán)，雖然其在尿液中因個(gè)體差異及肌酐清除率不同而有很大差別，但在正常人血清中C3d水平穩(wěn)定[18]。研究顯示，循環(huán)C3d結(jié)合型DSA的存在是診斷AMR時(shí)移植物丟失的獨(dú)立預(yù)測因子[19]。

對于移植術(shù)后慢性AMR的早期診斷，目前還沒有準(zhǔn)確性較高的方法。PRA是各種組織器官移植術(shù)前篩選致敏受者的重要指標(biāo)，與排斥反應(yīng)、受者和移植物存活率密切相關(guān)[20]。而與PRA相比，DSA監(jiān)測不僅能檢測供者HLA特異性抗體，還能檢測供者HLA交叉反應(yīng)抗原的抗體，因此能更準(zhǔn)確地反映受者體內(nèi)致敏情況[21]。目前國內(nèi)關(guān)于血清BAFF、C3d與移植術(shù)后AMR相關(guān)性的研究較少。移植術(shù)后移植物刺激機(jī)體產(chǎn)生各種免疫細(xì)胞，可能導(dǎo)致單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和活化的T細(xì)胞產(chǎn)生BAFF。這與Banham等[5]對腎移植術(shù)后血清BAFF的研究相似，該研究同樣顯示血清BAFF升高提示預(yù)后不良。國外諸多關(guān)于C3d的研究主要關(guān)注其在移植物中沉積的影響，結(jié)果顯示移植腎C3d沉積提示預(yù)后不良[14,17]，但對血清游離C3d研究較少。本研究評估了血清BAFF、C3d結(jié)合型DSA水平對同種異體腎移植術(shù)后慢性AMR的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示血清BAFF及C3d結(jié)合型DSA診斷慢性AMR準(zhǔn)確性均較高，二者無明顯差別。但是，本研究C3d的檢測是在DSA陽性或PRA強(qiáng)陽性的情況下進(jìn)行，而血清BAFF的檢測并不需要以PRA及DSA檢測結(jié)果作為基礎(chǔ)，故更為簡便。

總之，血清BAFF、C3d結(jié)合型DSA檢測對診斷腎移植術(shù)后慢性AMR有一定意義，對腎移植術(shù)后可能發(fā)生慢性AMR的受者可以考慮聯(lián)合應(yīng)用血清BAFF和C3d結(jié)合型DSA檢測協(xié)助診斷。然而本研究病例數(shù)較少，且缺乏移植腎病理兩種分子沉積的證據(jù)，故需要更多病例、更長隨訪時(shí)間的研究進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果。

1 Sola E, Gonzalez-Molina M, Cabello M, et al. Long-term improvement of deceased donor renal allograft survival since 1996: a single transplant center study[J]. Transplantation, 2010,89(6):714-720.

2 Gaston RS, Cecka JM, Kasiske BL, et al. Evidence for antibody-mediated injury as a major determinant of late kidney allograft failure[J]. Transplantation, 2010,90(1):68-74.

3 Xu H, He X, Sun J, et al. The expression of B-cell activating factor belonging to tumor necrosis factor superfamily (BAFF) significantly correlated with C4D in kidney allograft rejection[J]. Transplant Proc, 2009,41(1):112-116.

4 Thaunat O, Patey N, Gautreau C, et al. B cell survival in intragraft tertiary lymphoid organs after rituximab therapy[J]. Transplantation, 2008,85(11):1648-1653.

5 Banham G, Prezzi D, Harford S, et al. Elevated pretransplantation soluble BAFF is associated with an increased risk of acute antibody-mediated rejection[J]. Transplantation, 2013,96(4):413-420.

6 Gierej B, Górnicka B, Wasiutyński A. Role of C3d and C4d complement fragments in the diagnostics of acute allograft rejection after transplantations[J]. Ann Transplant, 2009,14(4): 61-70.

7 Herman J, Lerut E, Van Damme-Lombaerts R, et al. Capillary deposition of complement C4d and C3d in pediatric renal allograft biopsies[J]. Transplantation, 2005,79(10): 1435-1440.

8 R&D Systems, Inc. Human BAFF/BLyS/TNFSF13B immunoassay[EB/OL]. [2016-04-25]. https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/dblys0b.pdf.

9 Jung S, Oh EJ, Yang CW, et al. Comparative evaluation of ELISA and Luminex panel reactive antibody assays for HLA alloantibody screening[J]. Korean J Lab Med, 2009,29(5):473-480.

10 Clatworthy MR. Targeting B cells and antibody in transplantation[J]. Am J Transplant, 2011, 11(7):1359-1367.

11 Parsons RF, Vivek K, Redfield RR 3rd, et al. B lymphocyte homeostasis and BLyS-directed immunotherapy in transplantation[J]. Transplant Rev (Orlando), 2010,24(4):207-221.

12 Groom JR, Fletcher CA, Walters SN, et al. BAFF and MyD88 signals promote a lupuslike disease independent of T cells[J]. J Exp Med, 2007,204(8):1959-1971.

13 Banham GD, Clatworthy MR. B-cell biomarkers in transplantation—from genes to therapy[J]. Tissue Antigens, 2015,85(2):82-92.

14 Parsons RF, Yu M, Vivek K, et al. Murine islet allograft tolerance upon blockade of the B-lymphocyte stimulator, BLyS/BAFF[J]. Transplantation, 2012,93(7):676-685.

15 Xu H, He X, Liu Q, et al. Abnormal high expression of B-cell activating factor belonging to the TNF superfamily (BAFF) associated with long-term outcome in kidney transplant recipients[J]. Transplant Proc, 2009,41(5):1552-1556.

16 Thaunat O, Patey N, Gautreau C, et al. B cell survival in intragraft tertiary lymphoid organs after rituximab therapy[J]. Transplantation, 2008,85(11):1648-1653.

17 Porcheray F, Fraser JW, Gao B, et al. Polyreactive antibodies developing amidst humoral rejection of human kidney grafts bind apoptotic cells and activate complement[J]. Am J Transplant, 2013,13(10):2590-2600.

18 Porcheray F, DeVito J, Yeap BY, et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses[J]. Transplantation, 2010,89(10):1239-1246.

19 Sicard A, Ducreux S, Rabeyrin M, et al. Detection of C3d-binding donor-specific anti-HLA antibodies at diagnosis of humoral rejection predicts renal graft loss[J]. J Am Soc Nephrol, 2015,26(2):457-467.

20 Billen EV, Christiaans MH, van den Berg-Loonen EM, et al. Clinical relevance of Luminex donor-specific crossmatches: data from 165 renal transplants[J]. Tissue Antigens, 2009,74(3):205-212.

21 Loupy A, Lefaucheur C, Vernerey D, et al. Complement-binding anti-HLA antibodies and kidney-allograft survival[J]. N Engl J Med, 2013,369(13):1215-1226.

(本文編輯：鮑夏茜)

范博涵, 楊曉勇, 錢小松, 等. 血清B細(xì)胞刺激因子及C3d結(jié)合型供者特異性抗體在腎移植術(shù)后慢性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)中的診斷價(jià)值[J/CD]. 中華移植雜志: 電子版, 2016,10(4):165-168.

The value of serum B cell activating factor and C3d-binding donor specific antibody on diagnosis of chronic antibody mediated rejection after renal transplantation

FanBohan,YangXiaoyong,QianXiaosong,ZhangXinuo,LiuHang,WangWei,HuXiaopeng,ZhangXiaodong.

DepartmentofUrology,Chao-YangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,ChinaCorrespondingauthor:ZhangXiaodong,Email:zxd581@263.net

Objective To explore the value of serum B cell activating factor (BAFF) and C3d-binding donor specific antibody (DSA) on diagnosis of chronic antibody mediated rejection (CAMR) after renal transplantation. Methods The clinical data of 109 recipients who received renal transplantation in Beijing Chao-Yang Hospital during May 2010 to May 2012 was retrospectively analyzed. Incidence of CAMR in 3 years after renal transplantation was investigated. Once the recipients were diagnosed with CAMR, 5 mL of venous blood sample would be preserved, meanwhile, venous blood samples of recipients who recieved renal transplantation during the same period and without CAMR were also preserved. BAFF, panel reactive antibodies(PRA)and DSA were detected, furthermore, samples with strong positive PRA and DSA positive were detected with C3d-binding DSA. Then ROC curves with BAFF and C3d-binding DSA were analyzed. Results Ninteen cases among 109 recipients were diagnosed with CAMR. The venous blood samples of 19 recipients with CAMR and recipients who recieved renal transplantation during the same period and without CAMR were kept for (28±7) months and (27±5) months, respectively. Proportion of DSA and C3d-binding DSA positive and BAFF value of 19 recipients with CAMR and recipients who recieved renal transplantation during the same period and without chronic AMR were 52.6% vs 15.6%, 26.3% vs 3.1%, (2 070±825) pg/mL vs (790±293) pg/mL, respectively, which were all statically significant (χ2=43.59、6.18,t=23.745,Pall <0.05). The sensitivity, specificity, Youden index and area under the ROC curve of serum BAFF and C3d-binding DSA on diagnosis of CAMR were 83% vs 77%, 79% vs 83%, 0.62 vs 0.60 and 0.78 vs 0.79, respectively. There was no statistical difference on area under the ROC curve between the two groups (P>0.05). Conclusion Serum BAFF and C3d-binding DSA had certain value on diagnosis of CAMR, which could serve as a supplemental method for diagnosing CAMR in recipients at high risk.

Renal transplantation; B cell activating factor; C3d; Donor specific antibody; Antibody mediated rejection

10.3877/cma.j.issn.1674-3903.2016.04.004

北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(ZYLX201408)

100020 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院泌尿外科

張小東，Email：zxd581@263.net

2016-04-25)