液相色譜串聯質譜測定水產品中硝基呋喃類代謝物殘留

馬 駿，羅華明，張玲茜

(1.臺州市海洋環境監測中心,浙江臺州318000; 2.臺州市水產質量檢測中心,浙江臺州318000)

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液相色譜串聯質譜測定水產品中硝基呋喃類代謝物殘留

馬 駿1，2，羅華明2，張玲茜1

(1.臺州市海洋環境監測中心,浙江臺州318000; 2.臺州市水產質量檢測中心,浙江臺州318000)

摘 要：建立起一種用于測定水產品中呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮等代謝物殘留的高效液相色譜串聯質譜分析方法。樣品經乙腈提取,以二甲亞礬為衍生試劑,利用液相色譜串聯質譜進行分析測定。以乙腈和0.2%乙酸水溶液作為流動相,梯度洗脫,電噴霧正離子多反應模式監測。在0.5～10.0 μg·kg-1時,4種硝基呋喃類代謝物呈良好的線性關系,且回歸系數都在0.999以上,回收率為89.05%～95.51%,相對標準偏差為4.09%～5.05%。該方法靈敏、準確、高效,適用于水產品中硝基呋喃代謝物殘留的測定。

關鍵詞：硝基呋喃代謝物;液相色譜串聯質譜;儀器分析

文獻著錄格式:馬駿,羅華明,張玲茜.液相色譜串聯質譜測定水產品中硝基呋喃類代謝物殘留[J].浙江農業科學,2016,57 (4):558-562,610.

硝基呋喃類藥物(nitrofurans)是人工合成的一類具有5-硝基呋喃基本結構的廣譜抗菌藥物,主要包括呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮。呋喃唑酮具有廣譜抗菌活性,有單胺氧化酶抑制作用,可抑制苯丙胺等藥物的代謝而導致血壓升高,另外也可抑制乙醛脫氫酶的活性[1];呋喃妥因主要用于治療尿道感染,對大多數革蘭氏陽性和陰性菌,如大腸桿菌、腐生鏈球菌、腸球菌及變形桿菌,有殺滅或抑制作用,在尿道中具有較強的抗菌作用[2];呋喃西林主要供局部應用或創傷感染時外用消毒。

呋喃它酮具有強致癌性,呋喃唑酮具中等強度致癌性。1976年,美國食品和藥物管理局(FDA)指出:呋喃唑酮在動物體內降解非常迅速,可能具有致癌性[3]。Ali[4]通過對小白鼠和大白鼠的毒性研究表明,呋喃唑酮可以誘發乳腺癌和支氣管癌,并且存在劑量反應關系;高劑量飼喂食用魚和觀賞魚,可誘導魚的肝臟發生腫瘤[5];且能影響細胞的染色體交換和對損傷的修復,可使DNA單鏈發生內部交鏈從而抑制DNA的合成,并且能夠抑制RNA和蛋白質的合成[6]。

呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等硝基呋喃類藥物在體內代謝產物分別為3-氨基-2-唑烷基酮(簡稱AOZ,下同)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(簡稱AMOZ,下同)、氨基脲(簡稱SEM,下同)、1-氨基-2-內酰脲(簡稱AHD,下同)。呋喃唑酮進入體內后,代謝非常迅速。魚體內的半衰期僅0.27 h[7]。由于硝基呋喃類代謝物殘留具有較低的質量和微弱的紫外吸收特性,致使分析檢測變得困難。為了誘導分子紫外吸收,通常將代謝物用2-硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde,2-NBA)衍生,以使其代謝物能被液相色譜紫外檢測器檢測到。硝基呋喃代謝產物(AOZ,AMOZ,SEM,AHD)可在酸性條件下被水解,可同時用2-NBA衍生化。目前,對其代謝物殘留進行檢測主要有液相色譜-質譜(LC-MS)或液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)方法。本研究基于液相色譜-串聯質譜的高靈敏度,對水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量及其不確定度評定進行探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器

API300串聯四極桿質譜儀(美國ABI公司),配有電噴霧離子源(ESI源)和Agilent 1100 series高效液相色譜儀; Heraeus Biofuge Stratos臺式離心機; WH-866旋渦混合器; pH計;恒溫水浴振蕩器;電子天平;勻漿機;超純水器; OA-SYSTM氮吹儀; ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(2.1 mm× 150 mm×5 μm);

1.1.2試劑

標準品有呋喃唑酮代謝物AOZ、呋喃它酮代謝物AMOZ、呋喃西林代謝物SEM、呋喃妥因代謝物AHD,均由德國Dr.E公司提供。

衍生化試劑。稱取200 mg 2-NBA (Sigma公司,德國)溶于12.5 mL二甲亞礬中,現用現配。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯均為色譜級。

定容液。0.2%乙酸∶乙腈15∶85 (V/V),鹽酸溶液(0.2 mol·L-1),氫氧化鈉溶液(0.1,1 mol·L-1)。

1.1.3對蝦

對蝦樣品均由臺州市水產質量檢測中心提供。

1.2方法

1.2.1標準溶液的配制

標準儲備液(0.5 mg·mL-1)配制。精密稱取硝基呋喃類代謝物標準品AOZ,AMOZ,SEM,AHD,用甲醇定容,4℃以下保存。

標準工作溶液的配制。將標準儲備液用甲醇∶水按1∶1的體積比稀釋至相應濃度,4℃以下保存。

1.2.2樣品及標準品處理

參照GB/T 21311—2007進行操作。稱取2 g(精確至0.01 g)勻漿后的樣品于50 mL離心管中,加入0.2 mol·L-1鹽酸溶液20 mL和衍生化試劑1.0 mL,漩渦振蕩2 min,之后置于恒溫水浴振蕩器上37℃避光振蕩水解過夜(約16 h)。取出冷卻后,加入0.5 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液1 mL,然后用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0～ 7.5。加入乙酸乙酯10 mL,振搖1 min,4 000 r· min-1離心10 min,收集乙酸乙酯層,再用乙酸乙酯10 mL重復提取1次,合并乙酸乙酯層,50℃氮氣吹干,殘留物用1 mL含0.2%乙酸的15%乙腈水溶液超聲溶解,經0.22 μm微孔濾膜過濾后,取40 μL進樣檢測。

1.3HPLC-MS/MS檢測

1.3.1HPLC條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1 mm×150 mm×5 μm);柱溫為35℃;梯度洗脫程序見表1。

表1　流動相梯度洗脫程序

1.3.2質譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI);掃描方式為正離子掃描;檢測方式為多反應監測(MRM);電噴霧電壓(IS)為5 500 V;霧化氣(NEB)參數為10;氣簾氣( CUR )參數為11;碰撞氣(CAD)參數為6;輔助氣(AUX)流速為8 L· min-1;輔助氣溫度(TEM)為475℃;去簇電壓(DP)為50 V;聚焦電壓(FP)為350 V;碰撞室出口電壓(CXP)為13.0 V; Q1,Q3均為單位分辨率(UNIT)。定性離子對、定量離子對、采集時間(Dwell)及碰撞能量(CE)具體見表2。

表2　硝基呋喃類代謝物檢測的部分質譜參數

2　結果與分析

2.1測定方法的線性關系

采用內標法對定量離子對進行定量計算,以待測物濃度與內標物濃度的比值為橫坐標,以待測物峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標,建立線性關系(圖1)。

在待測物濃度0.5～10.0 μg·kg-1的范圍內,4種硝基呋喃類代謝物均呈良好的線性關系,回歸系數都在0.999以上。

圖1　硝基呋喃類代謝物的線性關系

2.2樣品測定

按照上述方法和條件對樣品進行檢測,得出的質譜圖見圖2。

2.3系統精密度

用所建立的檢測方法測定加標的同一對蝦樣品,測定結果見表3。

表3　系統精密度測定結果

2.4回收率

以對蝦空白樣品為試驗材料,并向空白樣品中分別添加濃度為0.5,1.0和5.0 μg·kg-1的標準品,然后按照上述方法進行水解衍生,提取凈化后用于測定,以內標法計算來驗證方法的回收率。結果見表4。

2.5質譜條件的優化

根據硝基呋喃類藥物分子的結構特征,選擇ESI ( + )作為電離模式,采用半自動進樣方式,分別用高濃度(1.0 mg·mL-1)的AMOZ,SEM,AHD和AOZ及同位素內標物AOZ-D4,AMOZ-D5,AHD-D3和SCA-13C-15N2的標準溶液在酸性條件下用2-硝基苯甲醛衍生化,然后調節pH值至近7.4,再用乙酸乙酯萃取2次,氮氣吹干,然后用甲醇/水溶液(1∶1,V/V)溶解殘留物。接著以流動注射的方式在正離子模式下對4種代謝物和4種內標物的衍生化產物進行母離子全掃描,確定AMOZ,SEM,AHD,AOZ,AOZ-D4,AMOZ-D5,AHD-D3和SCA-13C-15N2的m +1離子分別為m/z 335,m/z 209,m/z 249,m/z 236,m/z 240,m/z 340,m/z 252和m/z 212。然后分別以所得的m/z數為母離子,對其子離子進行全掃描,結果如圖3所示,并從中選取2個子離子。之后,多反應監測(MRM)優化去簇電壓(DP)、聚焦電壓(FP)、碰撞氣(CAD)、碰撞能量(CE)等質譜參數,結果顯示,以DP和CE對離子對的豐度影響最大(圖4)。

圖2　硝基呋喃類代謝物及內標物的提取離子色譜圖

表4　回收率測定結果

接著用FIA方式繼續優化霧化氣(NEB)、氣簾氣(CUR)、電噴霧電壓(IS)、輔助氣溫度(TEM)等參數。

圖3　子離子的掃描結果

圖4　不同質譜條件對離子對豐度的影響

3　小結

本文基于液相色譜-串聯質譜技術對水產品中硝基呋喃類代謝物殘留的測定方法進行研究,建立起一套基于高效液相色譜-串聯質譜可同時測定水產品中4種硝基呋喃類代謝物(AOZ,AMOZ,SEM,AHD)的方法。該方法在0.5～10.0 μg· kg-1線性良好。用內標法定量,樣品回收率在80%～110%,符合出口日本、歐盟等國家的最低殘留檢測限量要求(1 μg·kg-1)。

參考文獻:

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(責任編輯：高 峻)

中圖分類號：S668.4

文獻標志碼：A

文章編號：0528-9017(2016)04-0558-05

DOI10.16178/j.issn.0528-9017.20160433

收稿日期:2015-12-31

作者簡介:馬 駿(1982—),男,浙江臨海人,本科,工程師,主要從事水產品質量與海洋環境監測研究工作,E-mail:tzhyjmajun009@163.com。