TNF-α與ERK1/2在心臟毒素誘導的肌損傷再生修復中的作用研究

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510317 廣州，廣東省傳統醫學與運動傷害康復研究所,廣東省第二人民醫院

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TNF-α與ERK1/2在心臟毒素誘導的肌損傷再生修復中的作用研究

陳睿佘燕玲周珊瑤史華彩黎程

510317 廣州，廣東省傳統醫學與運動傷害康復研究所,廣東省第二人民醫院

【摘要】目的探討TNF-α與細胞外信號調節激酶 1/2 (ERK1/2)在骨骼肌損傷修復過程中的作用。方法將雄性C57BL6小鼠72只隨機分為6組，正常組(1個組)和損傷修復組(5個組)，于損傷修復組右側脛骨前肌注射心臟毒素(10 μM、100 μl)，分別于注射藥物后1、3、5、7、14 d處死5個損傷修復組，分離其脛骨前肌。用蘇木素-伊紅染色觀察脛骨前肌損傷修復情況，測定肌纖維橫切面積，用蛋白免疫印跡檢測肌組織蛋白中TNF-α、總ERK1/2、磷酸化ERK1/2、肌生成調節因子MyoD表達水平的變化。結果注射心臟毒素1 d后可觀察到脛骨前肌溶解、斷裂，14 d后損傷得到修復，后者與正常組的肌纖維橫切面積比較差異無統計學意義[(1 658.5±118.3)μm2vs.(1 625.2±151.7) μm2，P>0.05)]。蛋白免疫印跡檢測結果顯示，TNF-α和MyoD在損傷第1日及第3日表達水平上升，磷酸化ERK1/2于第5日表達水平上升。結論TNF-α與磷酸化ERK1/2可能分別于骨骼肌損傷修復的初期與后期發揮調節作用。

【關鍵詞】骨骼??；損傷修復；腫瘤壞死因子-α；細胞外信號調節激酶1/2

Extracellular regulated kinase1/2

TNF-α主要由單核細胞和巨噬細胞產生，是啟動抗菌炎癥反應的關鍵細胞因子，被認為是運動損傷、挫傷、肌肉減少癥、多肌炎、惡性肌萎縮等骨骼肌疾病的關鍵調節因子[1]。隨著對TNF-α研究的不斷深入，近年來有學者認為TNF-α可能通過不同信號途徑影響肌肉再生過程，但機制尚未明確[2-3]。細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)作為TNF-α下游因子，可參與細胞的增殖、分化[4]。本研究采用心臟毒素誘導骨骼肌損傷，通過觀察骨骼肌損傷修復過程中TNF-α、總ERK1/2 、磷酸化ERK1/2及肌生成調節因子MyoD的表達，研究TNF-α及ERK1/2在骨骼肌損傷修復中的作用，探討其可能的作用機制。

材料與方法

一、實驗動物

6～8周齡雄性C57BL6小鼠72只，SPF級，體質量18～22 g，購買并飼養于廣州中醫藥大學實驗中心。將72只小鼠隨機分為6組，每組12只。本研究對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

二、主要試劑

心臟毒素(Cardiotoxin，中鑫東泰納米基因生物技術有限公司)，蘇木素、伊紅(廣州市凱秀貿易有限公司)，ERK1/2抗體 (1∶1 000，美國CST公司)，磷酸化ERK1/2抗體 (1∶1 000，美國CST公司)，TNF-α(1∶500，美國CST公司)，成肌分化抗原抗體(1∶500，德國默克密理博)，α微管蛋白(α-Tubulin，1∶1 000，美國Abclonal公司)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔(1∶5 000，美國Abclonal公司)，全蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，增強化學發光法(ECL)發光試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)。

三、方法

1. 動物造模

6組小鼠分為正常組(1個組)及損傷修復組(5個組)。損傷修復組采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，分別于小鼠右側脛骨前肌局部注射100 μl的10 μM心臟毒素[5]。心臟毒素可選擇性地破壞細胞膜，藥物注射到脛骨前肌后，若觀察到小鼠該側后肢五爪提起呈彎曲勾狀，則判斷為造模成功。造模后5組損傷修復組分別于1、3、5、7、14 d麻醉取材后處死，每組12只小鼠中6只用于形態學觀察、6只用于蛋白免疫印跡檢測，5組損傷修復組分別標為D1、D3、D5、D7、D14組。

2. 取材

麻醉小鼠，仰位固定其四肢。分離小鼠小腿上部緊貼脛骨外側面肌肉，即為脛骨前肌，用生理鹽水沖洗脛骨前肌殘留的血液后將其迅速投入液氮，轉入-80℃冰箱保存或置于10%中性福爾馬林固定液中。

3. 蘇木素-伊紅(HE)染色

樣本于10%中性福爾馬林固定液中固定48 h后進行組織修塊、常規脫水，石蠟包埋。將包埋好的蠟塊固定于切片機上橫切，切片厚度為5 μm。用二甲苯脫蠟，再使用高濃度到低濃度乙醇脫去二甲苯，最后經過蒸餾水。用蘇木素染色3 min，再用1%鹽酸乙醇分化數秒。用自來水沖洗至細胞核呈藍色。用0.5%伊紅染細胞漿，常規脫水，中性樹脂封片[6]。最后在光學顯微鏡下進行組織學觀察。

4. 肌纖維橫切面積測定

樣本經HE染色后，將4組置于200倍放大倍數鏡下采集3張圖像，所得圖像用Image J分析軟件分析，測量每個樣本各視野肌纖維的面積，每個樣本大約選取200個肌纖維進行測量，邊緣不完整的肌纖維不納入統計。匯總每組6只小鼠肌纖維橫切面積測量值，計算均數和標準差[7]。由于心臟毒素注射后第1、3 日，肌纖維溶解、斷裂，結構不清，故僅分析正常組、注射后第5、7、14 日4組肌纖維橫切面積。

5. 蛋白提取定量

將組織從-80℃冰箱取出后，置于預冷的研缽中，邊加液氮邊進行研磨，直至將其研磨成粉末狀。隨后轉入預冷的裂解液中，使用電動勻漿器進一步勻漿，使其裂解完全。12 000 rpm、4℃離心10 min，提取上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)法進行定量，置于100℃變性5 min。

6. 蛋白免疫印跡檢測

取40 μg蛋白樣本加入十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGF)上樣孔中進行電泳。60 V下樣本跑進分離膠后轉100 V至溴酚藍到達分離膠底部。制備轉印夾層，用220 mA恒流轉膜100 min。用5%脫脂牛奶-磷酸鹽緩沖液將樣本置于室溫封閉1 h后加入一抗anti-ERK1/2 (1∶1 000)、anti-磷酸化ERK1/2 (1∶1 000)、anti-TNF-α(1∶500)、anti-MyoD (1∶500)、微管蛋白抗體(anti-Tubulin) (1∶1 000)，于4℃孵育過夜。用磷酸鹽緩沖液洗膜2次，1% 脫脂牛奶-磷酸鹽緩沖液洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔，1∶5 000)，用1%脫脂牛奶-磷酸鹽緩沖液清洗2次，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min。用ECL化學發光液顯色，Tanon天能系列全自動化學發光成像分析系統掃描成像。以α-Tubulin作為內參，各目的蛋白條帶與內參比較作為陽性條帶的相對表達值[8]。

四、統計學處理

結果

一、病理學觀察

HE染色后于光學顯微鏡下觀察各組病理學改變。結果顯示：正常組肌細胞形態正常，結構清晰，肌絲排列有序，間質未見炎癥細胞、充血等病理學改變；D1組可見大量骨骼肌纖維溶解、斷裂，部分肌纖維橫紋消失，出現凝固性壞死，空泡變性，間質見炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞為主；D3組可見大量骨骼肌纖維溶解，結構不清，肌纖維橫紋排列紊亂或消失，部分出現凝固性壞死，空泡變性；D5組可見不同程度的細胞活化增生，仍可見少部分細胞壞死，間質炎癥細胞浸潤，血管擴張充血；D7組細胞增生較D5組更加明顯，新增生的細胞與原有骨骼肌出現較好融合，部分出現肌纖維橫紋；D14組新增生的細胞逐漸和原有骨骼肌出現較好的融合，肌細胞形態清楚，結構正常，肌纖維橫紋排列整齊，間質未見炎癥細胞浸潤，血管未見擴張充血(圖1)。

圖1　各組脛骨前肌病理學觀察 (HE染色，×200)

二、肌纖維橫切面積測定結果

D5組及D7組肌纖維橫切面積明顯低于正常組，差異有統計學意義(P均<0.05)?；謴?4 d后的D14組肌纖維橫切面積增加，與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、2。

表1

各組肌纖維橫切面積比較±s)　μm2

注：總體比較F=177.565、P=0.922>0.05；與正常組比較，aP<0.05；與D14組比較，bP<0.05；與正常組比較，cP>0.05

表2

正常組與D14組大小肌纖維分布比例比較[中位數(下，上四分位數))]

注：2組各6只

三、蛋白免疫印跡檢測結果

注射心臟毒素后肌組織蛋白中TNF-α表達水平上升，于第5日開始下降。磷酸化ERK1/2在第5日表達水平上升。MyoD在正常組中不表達，注射心臟毒素后其表達水平先上升后下降，見圖2。

討論

本研究采用心臟毒素肌肉局部注射的方法建立肌損傷模型。心臟毒素是從眼鏡蛇毒腺中提取的一種毒素，有文獻報道，心臟毒素注入小鼠骨骼肌后30 min 即可引起肌肉組織的壞死，可見損傷區域漿膜斷裂，肌纖維攣縮，線粒體損害等病理改變，24 h 后即可見肌細胞胞質中僅包含有殘存的肌纖維和腫脹的線粒體[9]。骨骼肌受損及修復包含一系列過程，首先出現炎癥細胞應答，隨后靜止的肌衛星細胞被激活并表達成肌調節因子重新進入細胞循環，在肌源性前體細胞階段開始增殖分化形成肌管，肌管相互間融合形成新的肌纖維，新的肌纖維成熟伴隨肌肉功能恢復[10]。本研究組明顯觀察到脛骨前肌注入心臟毒素 1 d后出現肌纖維溶解、斷裂及凝固性壞死的現象，注射心臟毒素后3 d仍有大量的壞死肌纖維，注射后5 d可觀察到再生肌纖維，注射后7 d再生肌纖維取代大部分的壞死肌纖維，部分出現肌纖維橫紋，注射后14 d新增生的細胞和原有骨骼肌出現較好的融合，與正常組比較無明顯差異，且隨著損傷修復時間的延長，肌纖維橫截面積增加，注射心臟毒素后14 d肌纖維橫截面積與正常組比較差異無統計學意義。

近些年有學者認為TNF-α能通過不同信號途徑影響肌細胞凋亡及再生修復過程，對骨骼肌的損傷和修復可能起重要的調節作用。TNF-α在遺傳性及退化性骨骼肌患者血清中長時間表達水平上升，動物研究亦認為高水平TNF-α抑制肌分化融合，與肌萎縮關系密切[11]。Velders等[12]在大鼠右側腓腸肌注射虎蛇毒素24 h后觀察到其TNF-α mRNA及蛋白表達水平上升，而MyoD調節因子mRNA水平在3 d后急劇上升。體外研究顯示，在低濃度血清分化液中，原代骨骼肌細胞及C2C12小鼠成肌細胞系里，TNF-α表達水平上升。本研究結果顯示，在注射心臟毒素后，炎癥因子TNF-α與MyoD同步上升，隨后下降，提示TNF-α可能對生肌調節因子MyoD表達有一定的調節作用。

ERK、c-Jun氨基端激酶(JNK)、P38為有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族成員，MAPKs信號轉導通路存在于大多數細胞內，在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應(如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等)的過程中具有至關重要的作用。抑制ERK1/2磷酸化的表達可減少生肌素Myogenin的表達，減少單核成肌細胞融合形成為多核的肌纖維，敲除ERK2可使成肌細胞系C2C12失去肌融合能力[13]。高濃度TNF-α可抑制細胞分化融合，某些微小RNA可通過MAPK/ERK通路減少TNF-α對肌融合負調節作用[13-14]。體外實驗證明：在C2C12骨骼肌早期分化過程中，TNF-α和IGF-1經過MAPK/ERK信號通路調節特定的功能性微小RNA，如hsa-微小RNA-155、微小RNA-351、微小RNA-450b-5p、mmu-微小RNA-133b-3p，增加肌細胞融合指數[14]。本研究的結果顯示：正常組及損傷初期，肌衛星細胞激活及增殖過程中表達少量的磷酸化ERK1/2，在小鼠損傷恢復第5日，磷酸化ERK1/2表達水平明顯上升。結合形態學結果，損傷后第5日時新形成的肌管逐漸開始融合，形成肌纖維，我們推測磷酸化ERK1/2 可能對肌細胞融合起促進作用。

綜上所述，在骨骼肌損傷初期，靜止的肌衛星細胞被激活，生肌調節因子MyoD表達增加，可能與炎癥因子TNF-α在骨骼肌損傷初期表達水平上升有關。隨著損傷修復進程的發展，TNF-α表達水平減少，其下游因子磷酸化ERK1/2表達水平上升。我們推測TNF-α濃度降低可能促使磷酸化ERK1/2表達來介導肌管融合，促進新的肌纖維形成，但兩者間的相互作用需行進一步研究確定。

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(本文編輯：洪悅民)

Effect of TNF-α and ERK 1/2 on regeneration and repair of cardiotoxin-induced skeletal muscle injury

ChenRui,SheYanling,ZhouShanyao,ShiHuacai,LiCheng.

TraditionalMedicineandSportsInjuryRehabilitationInstituteofGuangdongProvince,GuangdongNo.2ProvincialPeople’sHospital,Guangzhou510317,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of tumor necrosis factor (TNF)-α and extracellular regulated kinase (ERK)1/2 in repairing the cardiotoxin-induced skeletal muscle injury. MethodsSeventy two C57BL6 male mice were randomly assigned into the normal group and five injury regeneration groups. The mice in the injury regeneration groups were administered with 100 μl of 10 μM cardiotoxin via the tibialis anterior. The tibialis anterior tissue was isolated at 1-, 3-, 5-, 7- and 14-d after cardiotoxin injection. The repair of skeletal muscle injury was observed and the cross-sectional area of muscle fiber was measured under hematoxylin and eosin staining. The expression levels of TNF-α, ERK1/2, phospho-ERK1/2 and MyoD in the muscle tissues were detected by western blot. ResultsThe signs of tibialis anterior myolysis and rupture were noted at 1 d after cardiotoxin injection, which were repaired at 14 d post-injection. The cross-sectional area did not significantly differ between the 14 d post-injection group and normal group,(1 658.5±118.3)μm2vs. (1 625.2±151.7) μm2，P>0.05. The expression of TNF-α and MyoD was up-regulated at 1 and 3 d after injection, and the level of phospho-ERK1/2 was raised at 5 d. ConclusionTNF-α level may play a role in the initial phase of muscle injury repair, whereas phospho-ERK1/2 probably exerts a regulatory effect during the advanced phase.

【Key words】Skeletal muscle; Injury regeneration; Tumor necrosis factor-α;

(收稿日期：2015-12-27)

Corresponding author,Chen Rui

通訊作者，陳睿

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.007

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