哇巴因對大鼠離體心功能作用的量-效關系

王海珍，史　娜，王耀軍，王竹青，李盼盼，姜玉新，王　靜，周萍萍，王海華

(皖南醫學院　1.生理教研室；2．臨床學院，安徽　蕪湖　241002)

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·基礎醫學·

哇巴因對大鼠離體心功能作用的量-效關系

王海珍1，史娜1，王耀軍2，王竹青2，李盼盼2，姜玉新1，王靜1，周萍萍1，王海華1

(皖南醫學院1.生理教研室；2．臨床學院，安徽蕪湖241002)

【摘要】目的：觀察不同濃度哇巴因(ouabain,OUA)對大鼠離體心功能的影響。方法：SD雄性大鼠隨機分成7組(n=6)：正常組(NC組)，OUA 10-9mol/L組，OUA 10-8mol/L組，OUA 10-7mol/L組，OUA 10-6mol/L組，OUA 10-5mol/L組，OUA 10-4mol/L組。左心室插管檢測各組大鼠離體心臟血流動力學指標：左室峰壓(LVSP)、心率(HR)、左室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)；觀察各組大鼠的心律失常發生情況并進行心律失常評分；檢測各組相同時間點的冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性，同時測定各組心肌組織中Na+-K+-ATP酶的活性，HE染色觀察各組大鼠心肌形態學變化。結果：同NC組相比，OUA 10-9mol/L組大鼠心臟LVSP×HR和+dp/dtmax無明顯差異(P>0.05)，OUA 10-8mol/L和10-7mol/L組大鼠心臟LVSP×HR和+dp/dtmax呈劑量升高而增強(P<0.05或P<0.01)；OUA 10-9mol/L、OUA 10-8mol/L組的Na+-K+-ATP酶的活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)；同NC組相比，OUA濃度在(10-6～10-4)mol/L時，OUA對各組大鼠的心功能呈劑量依賴性抑制作用(P<0.01)；各組大鼠的心律失常評分明顯升高；各時間點心臟灌流液中LDH的活性亦明顯升高，各組心肌組織Na+-K+-ATP酶活性均呈劑量依賴性降低(P<0.05或P<0.01)。結論：低濃度哇巴因[(10-9～10-7)mol/L]對大鼠離體心臟有強心作用，但隨著哇巴因濃度的升高[(10-6～10-4) mol/L]，轉為對心臟呈劑量依賴性抑制作用。

【關鍵詞】哇巴因;離體心臟;大鼠;濃度依賴

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.02.002

鈉泵又稱Na+-K+-ATP酶(NKA),是一種膜結合蛋白，在維持細胞內外電化學梯度、細胞滲透壓平衡和靜息電位中起關鍵作用。Na+-K+-ATP酶[1]是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體。鈉泵α亞單位存在哇巴因的結合位點，而β亞單位參與細胞間黏附作用。除了離子泵功能外，鈉泵還具有細胞受體的功能，配體通過與它結合，激活細胞內多種信號轉導通路，從而調節細胞的增殖、肥大、分化和存活以及腫瘤細胞凋亡等多種生理病理過程[2-3]。Na+-K+-ATP酶是目前所知哇巴因的唯一細胞膜表面受體,哇巴因可促進其內吞,加速酶降解，減少細胞內Na+-K+-ATP酶的總量。關于哇巴因對心臟的影響多是經過心肌細胞分離或是細胞培養來探討，而在器官水平對大鼠心臟作用的研究較為少見。本實驗擬通過離體心臟灌流標本，觀察不同濃度的哇巴因對大鼠離體心功能的量-效關系，初步探討其可能機制，為下一步實驗提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠(240±20)g購自合肥蜀山實驗動物中心，合格證號：SCXK(蘇)2009-0001。

1.2主要藥品試劑與儀器哇巴因為白色粉末，購自美國Sigma公司，將其溶解于無水乙醇中配成10-3mol/L的母液，-20 ℃避光保存以備用[4]；Medlab-U/8c生物信號采集系統和Langendorff離體心臟灌流裝置(南京美易科技有限公司)；RM6240BD型信號采集系統(成都儀器廠)；UV-3200PCS可見紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；D3024R高速微量冷凍離心機；美國賽默飛Multiskan GO全自動酶標儀；乳酸脫氫酶(LDH)和Na+-K+-ATP酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3Langendorff離體心臟灌流模型的制備大鼠稱重，麻醉(25%烏拉坦，4 mL/kg，ip)，開胸取心臟，迅速放入0～4 ℃的Krerbs-Henseleit(K-H)液中，清洗殘留血液，經主動脈逆行插管，懸掛于Langendorff灌注裝置，充以95%O2和5%CO2飽和氣體的K-H液恒溫(37 ℃)、恒壓(8.33 kPa)逆行灌注。

1.3.1實驗分組SD雄性大鼠隨機分為7組(n=6),NC組(正常K-H液灌流120 min);OUA(10-9～10-4)mol/L組[正常K-H液灌流30 min后給予含(10-9～10-4)mol/L OUA的K-H液灌流30 min，再給予正常K-H液灌流60 min]。

1.3.2血流動力學指標測定將左心室中充滿生理鹽水的乳膠小囊連接于多道生理記錄儀上(Medlab-U/8c生物信號采集系統，南京美易科技有限公司)，連續觀察 LVSP，+dp/dtmax，并記錄HR。

1.3.3心律失常評分待心臟復跳后，用自制的接觸電極沿心臟長軸方向垂直加壓于心尖部，參考電極置于主動脈根部，引導出心肌細胞的動作電位，連接于RM6240系統，引導出心肌細胞的單相動作電位。在哇巴因灌流15 min期間，取各種心律失常之和做出評分，評分參考Cuertis和Walker等人的評分規則[5]。

1.3.4生化指標檢測分別收集各組灌流后穩定點(0 min)、15 min、30 min、60 min、90 min的冠脈流出液，于-20 ℃凍存；各組心臟灌注結束點立即取出心臟，于預冷的生理鹽水中沖去血漬，去除心房和心室。留取心尖部心肌組織，稱取質量約0.2 g心室肌放入5 mL的小燒杯中，與預冷的勻漿介質(Tris 1.21 g/L，EDTA 37.23 mg/L，蔗糖34.2 g/L，再以200 mmol/L的HCl滴定至pH為7.4)1∶9配比。剪碎后倒入玻璃勻漿器中研磨成10%的混懸液，于普通離心機中3000 r/min離心10 min，取上清液放置-20 ℃保存[6]，以測定Na+-K+-ATP酶的活性：組織勻漿總蛋白含量測定采用BCA法，按說明配置好各種試劑，酶促反應后取上清液200 μL定磷，最后在660 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調零比色。冠脈流出液中LDH的活力采用微量酶標儀法，按試劑盒要求依次加入各種試劑后，在波長450 nm處，酶標儀測定吸光度。

1.3.5組織形態學檢測灌流結束后留取心肌，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，切片厚5 μm，進行HE染色，光學顯微鏡下進行組織形態學觀察。

2結果

2.1大鼠心功能指標與NC組相比，低濃度的哇巴因強心作用主要表現為，OUA 10-9mol/L組LVSP×HR無明顯差異，OUA 10-8mol/L、10-7mol/L組在哇巴因灌流期間及灌流結束后LVSP×HR明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且呈現出時間與濃度依賴性(圖1A)；在給予哇巴因灌流前，各組大鼠的+dp/dtmax無明顯差異(P>0.05)，哇巴因灌注期間及灌流結束后，+dp/dtmax明顯升高(P<0.05或P<0.01，表1)；高濃度則表現為抑制作用，同NC組相比，OUA(10-6～10-4)mol/L組在灌流期間及灌流結束后LVSP×HR明顯下降(P<0.01)，且呈現出時間與濃度依賴性(圖1B);在給予哇巴因灌流前，各組大鼠的+dp/dtmax無明顯差異(P>0.05)，哇巴因灌注之后，隨著時間的延長，表現為+dp/dtmax明顯降低，與NC組相比，具有顯著差異(P<0.05 或P<0.01)(表1)。

A.NC組，OUA 10-9mol/L組，OUA 10-8mol/L組，OUA10-7mol/L組；B.NC組，OUA 10-6mol/L組，OUA10-5mol/L組，OUA10-4mol/L組；*P<0.05，**P<0.01vs.NC group。

組別+dp/dtmax/(mmHg/s)0min15min30min60min90minNC組1912.93±34.911898.46±50.231879.01±65.051741.63±48.251662.85±34.86OUA10-9mol/L組1893.65±19.221975.32±76.79*1963.38±98.60*1777.85±39.301701.75±29.95OUA10-8mol/L組1896.38±29.391979.07±57.85*2062.75±68.52**1829.95±43.03**1747.83±38.40**OUA10-7mol/L組1873.77±45.292013.53±55.70**2105.57±55.32**1869.85±44.57**1802.67±20.45**OUA10-6mol/L組1932.81±39.601640.13±72.67**1282.81±45.50**1357.13±36.08**1295.83±41.67**OUA10-5mol/L組1895.65±22.701285.50±19.89**1072.34±44.46**1157.65±39.67**1094.75±45.37**OUA10-4mol/L組1911.15±30.871103.86±43.60**801.96±62.68**721.66±32.06**654.05±39.65**F1.94256.38399.87677.73821.72P>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01

*P<0.05，**P<0.01vsNC group。

2.2哇巴因灌流期間心律失常評分在哇巴因灌注15 min期間，NC組心律失常評分為1.10±0.08，OUA(10-9～10-7)mol/L組的心律失常評分分別為1.05±0.13、1.00±0.14、1.03±0.13,同正常組相比，無明顯差異(P>0.05);OUA(10-6～10-4)mol/L組的心律失常評分分別為2.95±0.13、3.68±0.15、4.33±0.13,與正常組相比,差異顯著(P<0.01)。

2.3OUA對冠脈流出液中LDH活性的影響如表2所示，在穩定點時各組大鼠灌流液中LDH的活性無明顯差異(P>0.05),經過哇巴因灌流30 min后，OUA(10-9～10-7) mol/L組LDH活性無明顯改變(P>0.05)，而OUA(10-6～10-4)mol/L組LDH活性均明顯升高，與NC組相比，具有顯著差異(P<0.01)。經過60 min的正常K-H液灌流后，與正常組相比，OUA(10-6～10-4)mol/L組LDH活性仍明顯升高(P<0.01)。

2.4形態學變化HE染色顯示NC組與OUA(10-9～10-7)mol/L組均表現為肌纖維排列整齊、結構完整，心肌細胞形態正常，排列有序，未見明顯腫脹和壞死，肌原纖維結構完整(圖2A～D);同NC組相比OUA(10-6～10-4)mol/L組出現肌纖維斷裂，心肌細胞間隙增寬，心肌細胞肥大、腫脹甚至壞死，且隨著濃度的增高，病理改變更為顯著(圖2E～G)。

組別LDH/(U/L)0min15min30min60min90minNC組18.54±0.7619.63±0.4520.36±1.0621.33±0.9722.28±0.69OUA10-9mol/L組17.94±0.9219.40±0.6320.27±0.7421.25±1.1622.79±0.53OUA10-8mol/L組17.88±0.7819.02±0.3819.97±0.7920.65±1.1722.58±0.50OUA10-7mol/L組18.35±0.8719.04±0.3921.01±0.5420.58±0.9623.01±0.74OUA10-6mol/L組18.23±0.9724.60±0.65**38.30±1.05**33.07±0.99**31.88±0.93**OUA10-5mol/L組19.31±0.8931.58±0.75**50.11±1.32**45.06±1.71**43.71±1.86**OUA10-4mol/L組17.84±0.6639.26±0.58**67.49±1.10**71.64±1.55**80.27±1.25**F2.251190.742261.811430.832587.24P>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01

*P<0.05，**P<0.01vsNC group。

A.NC組，B.OU A10-9mol/L組，C.OUA 10-8mol/L組，D.OUA 10-7mol/L組，E.OUA 10-6mol/L組，F.OUA 10-5mol/L組，G.OUA 10-4mol/L組。

圖2各組大鼠心肌 HE 染色結果(×400)

2.5哇巴因對大鼠心肌組織中Na+-K+-ATP酶活性的影響與NC組相比，OUA 10-9mol/L和OUA10-8mol/L組的Na+-K+-ATP酶活性明顯升高(P<0.05或P<0.01),OUA 10-7mol/L組心肌細胞膜內Na+-K+-ATP酶的活性無明顯差異(P>0.05)，而OUA 10-6mol/L組、OUA 10-5mol/L組及OUA 10-4mol/L組的Na+-K+-ATP酶活性明顯下降，差異具有統計學意義(F=154.71，P<0.01)。見圖3。

*P<0.05，**P<0.01vs.NC group。

圖3各組心肌細胞膜Na+-K+-ATP酶活力比較

3討論

哇巴因是強心苷類藥物，作用于心肌細胞膜上的鈉泵，導致細胞內Na+濃度升高，繼而Na+-Ca2+交換增強，胞內Ca2+濃度增加，心肌收縮力增加[7]。哇巴因還常用來復制心律失常動物模型，傳統認為其可能是通過抑制Na+-K+-ATP酶，使胞內的Na+和Ca2+濃度增加，引起心肌細胞鈣超載，觸發心肌電興奮的后除極，從而誘發快速型心律失常[8]。龔冬梅等人亦發現給予5 μmol/L 哇巴因10 min后可明顯縮短大鼠心室肌細胞動作電位時程，增加心肌細胞自律性，使除極和復極步調不能協調一致，易于產生異常沖動[9]。

我們的實驗結果顯示：較低濃度的OUA對離體心臟表現為強心作用，在OUA(10-9～10-7)mol/L組呈現出時間和濃度依賴性的強心作用，但Na+-K+-ATP酶的活力升高或沒有影響，提示低濃度的OUA的強心作用可能不是通過抑制鈉泵途徑升高Ca2+濃度，使心肌收縮力增強，而可能是通過配體-受體信號轉導通路實現的；Xie等[10-11]發現OUA可通過Na+-K+-ATP酶的信號轉導通路調節基因轉錄和細胞生長，同時也使心肌細胞鈣水平升高，進一步印證了我們的實驗現象，與NC組相比，OUA(10-9～10-7)mol/L組均未誘發心律失常，心肌冠脈流出液中LDH活性與心肌形態學均無明顯改變，這說明低濃度OUA除了增強離體心肌收縮力，還具有穩定心臟正常節律的作用；并且低濃度OUA與鈉泵結合后能調節心肌細胞的分化、增殖，而不會誘導凋亡。亦有文獻報道[12-13]OUA可抑制腫瘤細胞的增殖，有抗腫瘤的作用，但OUA低濃度范圍內對正常細胞無毒副作用。Tian J等[14]人用低濃度哇巴因作用于豬腎近曲小管上皮細胞，發現OUA激活了豬腎近曲小管上皮細胞內的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路,從而促進豬腎上皮細胞的增殖。

當鈉泵與哇巴因結合后，通過與周圍膜蛋白相互作用引發一系列復雜的信號級聯反應，其中包括Src(sarcoma gene)的活化、上皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)的激活、Ras與p42/44絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs)的活化、阻滯細胞周期以及活化ERK1/2(extracellular regulated protein kinases)，導致細胞周期抑制因子p21Cip1表達升高和腫瘤抑制蛋白p53表達降低介導細胞凋亡[15-16]。本研究發現，OUA(10-6～10-4)mol/L組在最初給藥時+dp/dtmax明顯升高(灌流1 min以內)，短時間升高后繼而出現一系列的毒害作用，收縮力下降，同時心律失常出現頻率增加，心率下降，最終表現為心臟做功明顯下降。同時灌流液中LDH的含量也明顯增多，心肌形態學改變明顯，心肌細胞間隙增寬，細胞水腫，碎裂等癥狀明顯，并且呈現出濃度依賴性及時間依賴性，心肌中Na+-K+-ATP酶的活性明顯下降,熊晨通過急性分離心室細胞發現，10-6mol/L的哇巴因可使心肌細胞出現不規則收縮，線粒體腫脹等毒害作用[17]。本實驗結果表明，高濃度的哇巴因不僅能夠抑制Na+-K+-ATP酶的活性，還能誘發心律失常，誘導心肌細胞的損傷、凋亡，從而對心臟呈現出劑量依賴性的抑制作用。

綜合不同濃度哇巴因對離體心臟的作用，我們可以看出，哇巴因對心功能的影響是一個復雜的過程，涉及到鈉泵的抑制與否，以及多條信號通路的激活，心律失常的發生等，關于具體通路與機制的研究有待于后續實驗的進一步探討。

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Dose-effect relationship of quabain on the cardiac function of isolated rat heart

WANGHaizhen，SHINa，WANGYaojun，WANGZhuqing,LIPanpan,JIANGYuxin,WANGJing,ZHOUPingping,WANGHaihua

Department of Physiology，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China

【Abstract】Objective：To observe the effect of different dosage of ouabain(OUA) on the isolated cardiac function in rats.Methods:Forty-two SD rats were randomized into 7 groups (n=6 for each)，namely：normal control group (NC group)，OUA 10-9mol/L group)，OUA 10-8mol/L group，OUA 10-7mol/L group，OUA 10-6mol/L group，OUA 10-5mol/L group and OUA 10-4mol/L group.Cardiac function index were evaluated by left ventricular systolic pressure (LVSP)，heart rate (HR)，the maximum upstroke velocity of intraventricular pressure (+dp/dtmax).The incidence of ventricular arrhythmias and arrhythmia score were determined.Coronary effluent was collected for estimating the activity of lactate dehydrogenase (LDH).The Na+-K+-ATPase content in myocardial tissues was determined，and myocardial injury was evaluated by H&E staining.Results:As compared with the NC group，The LVSP×HR and +dp/dtmaxon the OUA 10-9mol/L group had no significant difference (P>0.05 ) ,while the LVSP×HR and +dp/dtmaxwere increased on the OUA 10-8mol/L and 10-7mol/L groups (P<0.05 or P<0.01，respectively);The activity of Na+-K+-ATPase was significant higher in the OUA 10-9mol/L and 10-8mol/L groups(P<0.05 or P<0.01，respectively).OUA showed dose-dependent inhibition on cardiac function for each group rats with OUA concentration changing from 10-6mol/L to 10-4mol/L (P<0.01).The arrhythmia score was also enhanced significantly (P<0.01)，and the LDH level in coronary effluent was increased significantly.The activity of Na+-K+-ATPase of myocardial tissues showed a dose-dependent reduction (P<0.05 or P<0.01，respectively).Conclusion:Low concentration of OUA [(10-9～10-7mol/L)] can strengthen the cardiac function of the isolated heart，whereas excessive OUA[(10-6～10-4mol/L)] would inhibit the cardiac function in dose-dependent manner.

【Key words】ouabain;rats;isolated heart;dose-dependent

【文獻標識碼】【中圖號】R 541.7A

作者簡介：王海珍(1988-)，女，2013級碩士研究生，(電話)18375316283，(電子信箱)410960208@qq.com;

收稿日期：2015-09-04

基金項目：安徽省高校省級自然科學研究重點項目(KJ2013A251，KJ2016A729)；安徽省級大學生創新創業訓練計劃項目(AH201310368107)；皖南醫學院大學生科研基金資助項目(WK2013S22)；國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201510368009)

文章編號：1002-0217(2016)02-0108-05

王海華，男，副教授，碩士生導師，(電子信箱)wanghaihua9972@sina.com，通訊作者.