蒙藥珍寶丸對視網膜缺血再灌注損傷中的影響及ICAM-1，Caspase-3的表達

敖其爾 烏仁圖雅

(內蒙古醫科大學,內蒙古 呼和浩特 010010)

實驗研究

蒙藥珍寶丸對視網膜缺血再灌注損傷中的影響及ICAM-1，Caspase-3的表達

敖其爾 烏仁圖雅*

(內蒙古醫科大學,內蒙古 呼和浩特 010010)

觀察ICAM-1，caspase-3在RIR損傷中的表達及蒙藥珍寶丸對其的影響并探討其對RIR損傷中的保護作用。方法：用升高眼壓的方法制作兔視網膜缺血模型，在不同時間觀察95只家兔視網膜組織病理學改變及ICAM-1，caspase-3的表達。結果：模型組視網膜神經節細胞層，內核層細胞數減少，出現大量的水腫和空泡，內核層細胞排列紊亂。缺血再灌注后6h起改變明顯，24h達到高峰72h水腫和空泡減少，視網膜明顯變薄。珍寶丸組水腫和空泡現象較模型組輕，內核層和神經節細胞數較模型組多，視網膜較厚，細胞排列有序。ICAM-1，caspase-3的表達6h起明顯，24h達到高峰，72h仍少量表達。珍寶丸治療組各觀察指標表達變化規律與缺血再灌注組基本一致，但均較缺血再灌注組明顯下降。結論：1.RIR損傷中ICAM-1，caspase-3的表達增高。2.珍寶丸對RIR損傷中ICAM-1，caspase-3的表達有抑制作用。3.珍寶丸對RIR損傷有保護作用。

RIR損傷;珍寶丸;ICAM-1;caspase-3

珍寶丸又名額爾敦-烏日勒，是臨床上常用的傳統蒙藥。有清陳熱，祛黃水，護白脈等功能[1]。本方性涼，是蒙醫在臨床治療腦神經系統疾病、心血管疾病和各種疑難病的常用藥。珍寶丸以其組方主從關系嚴謹，用藥量少，藥力獨到，療效卓著的特點，具有“神藥”之稱[2]。 為探討珍寶丸對視網膜缺血再灌注損傷中的作用及原理本實驗對RIR損傷中ICAM-1，caspase-3表達進行研究。

1 材料與方法

1.1 動物與分組:健康成年無眼疾家兔95只，體重2.5～3kg，隨機分為正常組(5只)、模型組(30只)、珍寶丸組(30只)、維生素E組(30只)。后三組根據缺血再關注時間分為1h、6h、12h、24h、48h、72h組，每組(5只)。

1.2 主要試劑和設備:蒙藥珍寶丸由內蒙古蒙藥股份有限公司提供。維他命E由浙江醫藥股份有限公司提供。ICAM-1免疫組化試劑盒，Caspase-3免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，Poly-L-Lysine粘片劑由北京來福試劑公司提供。SABC試劑盒由武漢博士德公司提供。OLYMPUS光學顯微鏡，顯微攝像系統由日本生產。OPTONVIDAS圖像分析儀由德國生產。YZ直接檢眼鏡由蘇州醫療器械廠生產。

1.3 動物模型的制備:RIR組、珍寶丸組和VE組動物稱重后采用20%烏拉坦5ml/kg從耳緣靜脈輸入，同時兔眼滴用1%的地卡因表面麻醉，復方托品酞胺散瞳。麻醉成功后固定于自制的固定板上，將連接生理鹽水瓶輸液管的7號針頭刺入兔右眼前房，避免損傷虹膜及晶狀體，然后升高輸液瓶至與實驗眼垂直距離150cm處，此高度在眼內形成110mmHg(14.46kpa)的眼內壓，此壓力接近兔的體循環收縮壓[4]。能完全造成視網膜血流阻斷，直接檢眼鏡下可見視網膜蒼白水腫，眼底血流阻斷；維持60分鐘后緩慢降低生理鹽水瓶至與家兔在同一水平，使視網膜恢復血液供應，留針1分鐘，拔除穿刺針，結膜囊涂紅霉素眼膏防止感染，分籠飼養。期間每日雙眼滴氯霉素眼藥水2次維持角膜濕潤和防止感染。

1.4 給藥方法:在造模前7天連續灌胃給藥，珍寶丸組0.15g/kg和VE組100mg/kg(1次/日)。正常組和模型組給予等量生理鹽水。再灌注期間也同樣劑量給藥。

1.5 試驗方法

1.5.1 標本制作:分別于再灌注后1h、6h、12h、24h、48h、72h采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死動物，立即摘除眼球，4%多聚甲醛中性緩沖液固定24h。流水沖洗24h，脫水，透明，包埋，連續切片(厚度4um)。常規HE染色，光鏡下觀察。

1.5.2 ICAM-1，caspase-3的免疫組化檢測切片用SABC免疫組化法染色，按ICAM-1，caspase-3試劑盒使用說明書進行檢測。圖像分析系統觀察拍照。

1.5.3 統計學分析:采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。測定結果以X±S表示。組間進行單因素方差分析并進行兩兩比較，組內各時段做隨機區組設計的方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 視網膜的ICAM-1的表達

正常組：視網膜中ICAM-1微量表達。

模型組：缺血再灌注6h始在視網膜神經纖維層，內外核層少量表達，12h表達明顯升高，24h(圖1)達到高峰，48h始表達下降，72h仍少量表達。

珍寶丸組：視網膜ICAM-1蛋白表達變化規律與模型組相似，平均表達量較RIR組少，各時段表達量較RIR組相同時段少。

VE組：各時段表達均較RIR組相同時段低，各個時段表達均較珍寶丸組高(表1)。

表1 視網膜缺血再灌注損傷后不同時段ICAM-1的表達變化(灰度，單位：um)

注：灰度值范圍在0～255,0為最黑，255為最亮。各組與正常組、模型組、VE組、給藥組有統計學意義的依次標為1、2、3、4.

2.2 視網膜的Caspase-3的表達

正常組：視網膜中Caspase-3微量表達。

模型組：缺血再灌注6h始在視網膜神經節細胞層，內核層，內網織層表達開始明顯。 24h達到高峰(圖2)。48h始表達下降，72h仍少量表達。

珍寶丸組：視網膜ICAM-1蛋白表達變化規律與模型組相似，平均表達量較RIR組少，除1h組各時段表達量較RIR組相同時段少。

VE組：除1h組各時段表達均較RIR組相同時段低，除1h組各個時段表達均較珍寶丸組高(見表2)。

表2 視網膜缺血再灌注損傷后不同時段Caspase-3的表達變化(灰度，單位：um)

注：灰度值范圍在0～255,0為最黑，255為最亮。各組與正常組、模型組、VE組、給藥組有統計學意義的依次標為1、2、3、4.

2.3 RIR損傷的組織病理學改變：模型組1h組視網膜神經纖維層和內叢狀層出現輕度水腫，6h組水腫明顯，少量空泡出現，神經節細胞減少。12h后水腫和空泡現象嚴重，神經節細胞進一步減少，排列稀疏。內外核層密度均降低，排列紊亂，出現核碎裂，溶解和壞死。72h視網膜明顯變薄，水腫減輕，細胞數量稀少。珍寶丸組水腫和內外核層密度降低等現象輕且出現時間晚。節細胞排列較規整，數量也多于未治療組。

3 結論

從上述結果中得出以下結論：ICAM-1，caspase-3在24h灰度最小，說明表達最強。損傷最嚴重。珍寶丸組的平均灰度高于模型組和VE組，差異有統計學意義(P<0.05)。說明珍寶丸對ICAM-1，caspase-3的表達有抑制作用，對視網膜缺血再關注損傷有保護作用。

4 討論

視網膜缺血再灌注損傷是眼科常見的病理學改變。如視網膜中央動脈阻塞、分支動脈阻塞、青光眼、缺血性視神經病變等, 均可造成視網膜組織的缺血。在血液再通后, 往往對視網膜造成更為嚴重的損傷。因此, 積極探尋各種保護視網膜再灌注損傷的治療方法具有重要的臨床意義[4]。目前的研究表明它是多種因素綜合作用的結果,如氧自由基的損傷、微血管的損傷、白細胞的作用和鈣超載等[5]。目前研究發現,視網膜缺血再灌注損傷中存在著神經細胞凋亡現象, 且凋亡是視網膜神經細胞丟失的重要因素之[6]。其中細胞間黏附分子-1(ICAM-1) 是在血管內皮細胞表達的免疫球蛋白家族成員之一。它可作為配基與白細胞表面的VFA-1 和MAC-1 分子結合,介導白細胞與血管壁內細胞的黏附及白細胞穿出血管壁,從而導致缺血再灌注組織的損傷[7]。凋亡蛋白酶(caspases)是一組對底物天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。目前已發現該蛋白酶家族至少有13個成員，caspase在凋亡中所起的主要作用是：滅活細胞凋亡的抑制物；水解細胞的蛋白質結構，導致細胞結體，形成凋亡小體：在凋亡級聯反應中水解相關活性蛋白，從而使該蛋白獲得或喪失某種生物學功能[8]。其中caspase-3是哺乳類動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶，是細胞進入凋亡程序的特異性標志物。一般認為它在細胞凋亡過程中是最重要的終末剪切酶,在細胞凋亡中起著不可替代的劊子手作用。[9]

蒙藥珍寶丸又名額爾敦烏日勒，出自《秘訣增補篇》。是由珍珠、麝香、牛黃等珍貴藥品組成的傳統蒙藥。主治白脈病，黑脈病，中風，痛風及各種頑癥。藥理試驗證明此藥具有擴張毛細血管，促進微循環，降低血黏度，促進血液流通，減慢心率，降低心臟耗氧率，提高缺氧耐受度，抗血小板凝集，抗血栓形成，恢復神經細胞損傷，抗脂肪酸過氧化，清除氧自由基等作用[10]。據報道蒙藥珍寶丸具有明顯改善急性血瘀癥模型大鼠異常的血液流變學狀態，明顯抑制異常增高的血細胞聚集作用[11]。對氧自由基有很強的清除和抑制作用[12]。對腦缺血再灌注損傷也有保護作用[13]。

我們通過兔RIR模型中應用免疫組織化學方法檢測了，caspase-3的表達變化。發現視網膜缺血再灌注后ICAM-1，caspase-3表達增加，缺血再灌注后6h開始表達明顯，24h達高峰，48h后漸減少，至72h仍有表達。珍寶丸治療組各觀察指標表達變化規律與RIR組基本一致，但均較RIR組明顯下降。本研究顯示，在RIR損傷中珍寶丸能降低ICAM-1，caspase-3的表達，且在一定程度上能夠減輕視網膜組織的損傷。但因具體機理十分復雜，闡述還遠不夠完善，尚待進一步研究。

[1]包特木爾. 蒙藥方劑學[M].內蒙古人民出版社，1986 .262

[2]李志起.從蒙藥珍寶丸的成功看處方藥如何突圍[J].中國醫藥導報,2006,3 (22):82～83.

[3]osborne NN,Casson RJ,Wood JP,et al.Chidlow G.Graham M..Melena J. Retinal ischemia:mechanisms of damage and potential therapeutic strategies[J].Brain Res Bull ,2004,62(6)：525～528

[4]游志鵬.趙菊蓮.汪昌運等.β-七葉皂甙鈉對大鼠視網膜缺血再灌注損傷中單核細胞趨化因子-1表達的影響[J].中國現代醫學雜志,2006.16(19):2925-2927

[5]游志鵬,姜德詠,等.一氧化氮合酶在大鼠視網膜缺血再灌注損傷中的表達及意義[J].眼視光學雜志,2003,5(4):237-238

[6]牛膺筠,趙穎,賈新國,等.視網膜缺血再灌注損傷后HSP70、NF2κB的表達和細胞凋亡的關系[J].眼科研究,2005. 23(4)：377-379

[7]劉湘平,游志鵬,姜德詠,等.大鼠視網膜缺血再灌注損傷中ICAM-1 mRNA的表達及意義[J].醫學臨床研究,2004.21(10):1142-1144

[8]金惠銘.病理生理學[M].第五版.人民衛生出版社,180

[9]傅映暉，許軍，張勁松,等.大鼠視網膜缺血2再灌注損傷后P38絲裂原活化蛋白激酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶表達的變化及尼莫地平對二者的影響[J].中華眼科雜志,2006.42(5):435-442

[10]策·蘇榮扎布,羅布桑,巴· 吉格木德,等.蒙古學百科全書·醫學卷[M].呼和浩特:內蒙古人民出版社,2004(蒙文版):133～134.

[11]楊哲慧.蒙藥—珍珠丸對大鼠血瘀癥模型血液流變學的影響[J].當代醫學, 2009,15(6) :142-143

[12]孫福祥,孫成元,楊明霞,等.珍珠丸清除氧自由基的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志,2004,10(2):65

[13]麻春節,韓雪梅,等.加減補陽還五湯和額爾敦烏日樂對大白兔腦缺血的保護作用及血液流變的影響[J].中醫藥學刊,2002,20(2):22

2016年6月20日收稿

烏仁圖雅 聯系電話15947717089 郵箱：379557177@qq.com

R291.2

A

1006-6810(2016)10-0059-03