在石家莊跟世界一流較勁，韓春雨“一鳴驚人”

令人吃驚的是，河北科技大學副教授韓春雨團隊的研究優于麻省理工、哈佛、斯坦福等名校的同行

2016年5月2日，韓春雨與合作者的文章終于發表了—先被《科學》（Science）審稿小半年后拒稿，后歷時9個月終被《自然生物技術》（Nature Biotechnology）接收。

接下來的幾天里，他每天都會收到幾十上百封來自同行的郵件，但并非每封都能及時回復。

“實驗室人手有限，處理不過來那么多郵件，還望同行海涵。”韓春雨在電話里說，滿是歉意。他和合作者發明的新的基因編輯技術，正引起國內同行的熱切關注。他們紛紛追問：“誰是韓春雨？”

更精確，效率更高

42歲的韓春雨是河北科技大學副教授，因為新發表的工作“一鳴驚人”。

簡單地說，韓春雨團隊發明了一種新的基因編輯技術（NgAgo-gDNA），適合在人類細胞中基因組編輯，不同于已有最時興的技術（CRISPR-Cas9）。后者通過RNA尋找替換序列，而新技術通過DNA作為介導尋找替換目標。

NgAgo是短語Natronobacterium gregoryi Argonaute的簡稱。韓春雨團隊就是利用格氏嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute實現了DNA引導的基因組編輯，并發現NgAgo作為一種DNA介導的核酸內切酶，適合在人體細胞中進行基因組編輯。

Argonaute作為一個核酸內切酶家族，最早由荷蘭瓦赫寧恩大學的約翰-范德歐斯特研究組證明這一家族的同源蛋白酶活，可以有效地利用單鏈脫氧核糖核酸作為短介質，去相對精準地切割基因組靶點。

范德歐斯特的這一發現開啟了基因組工程的新篇章，因為之前的大多數基因組工程研究是基于RNA的（CRISPR-Cas9、TALEN等，鋅指蛋白是基于DNA的但是沒有實現可編碼的優勢），哈佛大學分子與細胞生物系副研究員段昕認為，“這一進展給大家引入了一個新的思路去進一步改造”。

韓春雨對自己的工作很有自信

目前世界各個實驗室最為流行的基因編輯工具是CRISPR-Cas9。從原理上來說，早期的DNA編輯技術是通過蛋白（如鋅指蛋白）來尋找需要替換的序列，Cas9則是通過RNA（引導RNA，即gRNA）來尋找替換的序列，由于比操作蛋白質簡單得多，Cas9技術迅速被廣泛使用。

但是，Cas9需要19個配對的堿基，并且要求在需要編輯的基因組上這19個堿基后面必須緊鄰一個符合一定特征的三堿基序列（PAM序列），這在一定程度上限制了gRNA的設計，而NgAgo–gDNA系統不需要PAM序列，拓寬了其設計范圍。

NgAgo結合24個堿基的gDNA，比Cas9的gRNA（19個堿基）要長5個堿基，理論上其精確性要提高1024（4的5次方）倍。DNA編輯相當于在一本書中的某個位置找到一個單詞將它替換成另一個單詞，并且要保證書中其它地方的單詞不被替換。顯而易見，如果替換的是the這樣的簡單單詞，那么可能從書中找到多個地方，而找pneumonoultramicroscopicsilicovolcanoconiosi這樣的單詞則不太可能找錯。

韓春雨團隊的研究還發現，NgAgo–gDNA系統對向導序列-靶序列錯配容忍度很低。gDNA上任何一個堿基的變換都會降低NgAgo的切割效率，如有三個錯配則使其完全失活。這在另外一個機制上提高了NgAgo使用的精確性，特別是一些富含GC序列的地方，NgAgo系統比Cas9系統效率更高。

韓春雨團隊在論文中還介紹，與Cas9相似，Argonautes在基因表達抑制及抵御外源核酸中起關鍵作用。但是，Argonautes在許多方面不同于Cas9。比如，Cas9只存在于原核生物中，而Argonautes在進化過程中保守，存在于幾乎所有生物體中;盡管大多數的Argonautes結合單鏈（ss）RNAs，在RNA沉默中起重要作用，一些Argonautes卻可以結合ssDNAs并切割靶DNA;正確的Cas9結合要求向導RNA必須有一個3′RNA-RNA雜化結構，Argonaute結合則不要求特異的一致的向導RNA二級結構;Cas9只可以切割PAM上游的靶序列，而Argonaute不要求靶序列上存在特異的序列。當Argonaute與向導序列結合時，它們可以影響彼此的生物化學特性，并作為一個整體起作用。

“因此，從理論上說，NgAgo的脫靶率更低”，韓春雨說。

荷蘭瓦赫寧恩大學約翰-范德歐斯特研究團隊

“幸好NgAgo足夠給力”

韓春雨是石家莊人，本科畢業于石家莊的河北師范大學，他父母也在該校任教。

1995年，韓春雨來到北京，先在中國農業科學院攻讀碩士學位，后在中國協和醫科大學（中國醫學科學院）接受博士研究生訓練，2003年獲得博士學位。此后，他并沒有尋找教職，在協和的實驗室繼續一項關于“人類Bex2與LMO2相互作用、調節新型DNA結合復合物的轉錄活性”的研究，2005年該結果發表在《核酸研究》（Nucleic Acids Research），韓春雨為第一作者，這篇文章也成為他科研生涯中具有標志性的成果。

2006年，32歲的韓春雨離開北京，到河北科技大學擔任教職。十年后，他發表了獨立研究生涯以來最為重要的工作。

韓春雨的研究方向是真核基因表達調控，特別是和腫瘤相關的基因，以及表觀遺傳相關蛋白，RNA的功能研究，例如，長非編碼RNA的功能及其他。近些年基因編輯技術，尤其是CRISPR-Cas9的不斷完善，深刻地影響到整個生命科學領域，韓春雨的實驗室也用上了CRISPR-Cas9這一工具，他本人也一直在關注基因編輯領域的進展，有過一些想法，但并沒有下決心動手。

促使韓春雨真正動手的是2014年年初的兩篇文獻，其中一篇是范德歐斯特研究組發表在《自然》（Nature）雜志的。段昕介紹，范德歐斯特工作的局限性在于他們實驗所需要的溫度在65-75攝氏度，這使得很多實驗不能在生理條件（哺乳動物在37攝氏度左右）下完成。

當時，北京大學一位研究員得知范德歐斯特的研究后非常興奮。他判斷，TtAgo可以發展為一個更簡單的基因編輯工具，并產生了一個想法：哺乳動物中是否在特定時期或特定細胞中存在類似現象，比如決定細胞分化或抗體形成的過程。不過，他的實驗室在合成了人源密碼子優化的TtAGO 后，嘗試了幾次切GFP序列，卻以失敗告終。

幾乎在同一時間，韓春雨的實驗室進展則十分順利，“大概是兩個月就有結果出來了”。

段昕介紹，韓春雨團隊做的，就是進一步搜尋Argonaute的同源蛋白。幸運的是，大量的已知大型測序數據給了他們很多有效的幫助，找到并進一步證明了來自不同菌株格氏嗜鹽堿桿菌的Argonaute同源蛋白可以在生理條件下實現類似的功能。“韓的工作把系統進一步優化，而且使得短介導DNA的準確性和識別長度有了重大突破。”段昕說。

北京大學生命科學學院研究員魏文勝課題組也想嘗試DNA介導的Argonaute，但TtAGO的特點是工作溫度比較高。“這篇文章比較聰明，還是走對了路，沒有研究如何使高溫才能工作的酶通過構象改變達到降溫，而是找到這樣一株可以在37度工作的Argonaute。” 魏文勝說。

之后，韓春雨一邊向《科學》雜志投稿，一邊和實驗室的幾個學生一起完善結果。當時文章最主要的結果是NgAgo確實可以做基因編輯工具，但“審稿人要求的比較完美”，來回審了小半年之后，“最后被拒了”。

2014年秋天，韓春雨跟沈嘯提起自己正在做的NgAgo的工作，提出了幾個候選的工具。“這么好的課題和想法，我當然全力支持并加入了。”沈嘯回憶道。他是浙江大學醫學院基礎醫學系研究員，在中國協和醫科大學博士畢業前一年，與韓春雨合作了發表在《核酸研究》的論文。2003年博士畢業以后，沈嘯曾在美國一所大學從事博士后研究，2015年入選浙江大學“百人計劃”。

在被《科學》拒稿后，韓春雨和實驗室的學生繼續補充實驗，而沈嘯在項目和實驗設計上提供建議，他們發現了更多關于NgAgo的特性。

“幸好NgAgo也比較給力，發現它是one-guide faithful的。”韓春雨笑著說。

2015年6月3日，這篇僅有五人署名的文章的被投往《自然生物技術》，9個月之后，文章被接收，2016年5月2日在線發表。

“文章發出來是好事，也是壞事”

在整個生物界唯強大的CRISPR-Cas9馬首是瞻的時代，韓春雨的這一發現引發了諸多媒體和同行的熱情關注。

有評論認為，“（如果）未來中國任何一所普通的科研院校都能出現這種激動人心的科研成果，那么中國的科研實力才是真正的達到世界領先水平”。

國內關注生物行業的媒體評價說，“該成果核心為一項替代目前通用的Cas9的基因組編輯新技術，這一成果打破了國際基因編輯技術的壟斷”。

韓春雨對此評價不敢茍同，他認為，NgAgo–gDNA系統和Cas9都為基因編輯應用提供了更好的工具和多樣化的選擇，各有各的用處。

沈嘯則對NgAgo可以取代Cas9 的評價持謹慎態度，“最客觀的說法是找到了新的基因編輯工具”。他認為，Cas9基因編輯系統有點復雜，每當把它某一個劣勢用某種技巧修正后，使之特性更高、更有效，就會是一篇很好的論文，每進行一個改良，就是一篇CNS的論文。“大部分人包括一些科學家可能自然而然受一種權威的影響，Cas9太強大了，大家都把目光集中在Cas9上，想怎么磨這把刀，把它做得更好更漂亮。”

正是因為Cas9太熱，很多人就忽視了去尋找更好的甚至先天就可以規避這些問題的工具。前述的北京大學研究員透露，他們2014年也在做TtAGO的實驗，但部分因為依賴Cas9而放棄繼續研究Argonaute 。“學生覺得不太靠譜，而實驗室里其他人Cas9 用得十分熟練，都覺得沒有必要再換了，我也沒有堅持。”他不無遺憾地說。

韓春雨團隊的工作已經證實了一個新的、有自己特點和優勢的基因編輯工具，但是如何利用它，找到它更多的特性，還有很多工作要做。

“我和韓春雨現在是非常非常急迫的心理，文章發出來是好事也是壞事，好事是這項工作讓大家知道了，壞事是大范圍的競爭，我們的工作是不是能趕上趟，繼續做下去，是不是我們中國的科學家還能繼續報道它。”沈嘯說，國外的很多實驗室設備條件非常強，“我們沒法比，他們一上來做的話，很多東西會很快出結果。”

石家莊的四人實驗室

無論是在微信圈還是海外華人的論壇，人們不約而同地將韓春雨和麻省理工學院博德研究所的核心研究員張鋒聯系起來。1981年出生的張鋒同樣來自石家莊，以在基因編輯領域的諸多貢獻而被人們所熟知，包括首次報告了CRISPR-Cas9在哺乳動物體基因組編輯中的應用，找到更小的Cpf1蛋白來替代Cas9酶。

與韓春雨一直在國內接受科學訓練、從事研究不同，張鋒有海外學習的背景，更有在知名實驗室研究的經歷。11歲那年，張鋒隨母親到美國愛荷華州的得梅因定居，高中時就在一個基因治療實驗室實習，全獎進入哈佛大學學習化學和物理學，期間跟隨知名華人科學家莊小威做過研究，后來到光遺傳學主要發明人之一卡爾·戴瑟羅特（Karl Deisseroth）在斯坦福大學的實驗室，參與到光遺傳學發明的部分工作。在哈佛大學短暫地停留之后，張鋒受聘于博德研究所，一個科研經費和研究人員都可以在美國排到前列的研究機構。

而在河北科技大學生物科學與工程學院的實驗室，“離心機是‘飛鴿牌，與國內自行車品牌相同，從0加速到12000轉大概需要1分鐘的時間，”韓春雨不無幽默地說。

直到今天，韓春雨所在的的生物科學與工程學院還沒有博士點，韓春雨實驗室的學生都是碩士研究生。理論上，韓春雨每年可以招五六個碩士研究生，但是真正能夠跟他一起專注科研的，也只有一兩個人。

包括《自然生物技術》的這篇論文，跟韓春雨一起做實驗的一共三個人，其中第一作者高峰兩年前就從河北科技大學碩士畢業，那時NgAgo的主要結果剛剛做出來，高峰沒去找工作，也沒有申請博士，而是留在導師韓春雨的實驗室繼續工作，為了省錢，甚至睡覺都在實驗室。這一情景與韓春雨當年博士畢業后留在協和繼續未完成的科研工作有著驚人的相似。

“韓實驗室的工作是很了不起的。”北京大學生命科學學院饒毅實驗室研究生張翼評論說，“他們唯一的生物信息學工具可能是NCBI-psiBLAST，他們的Argonaute都是從菌種庫買來的菌里面克隆出來，根本沒有花錢合成基因。”即使是在這么艱難的工作環境下，他們不僅找到了NBT文章中報道的NgAgo，還找到了（他們專利里報道的）一大堆別的Ago，都具有在低溫（10-50攝氏度）下結合5p-ssDNA，造成靶DNA雙鏈斷裂的能力。

很多人對韓春雨能夠在如此簡陋的環境下取得開創性的工作感到驚訝，但在他的大學同學、河北師范大學特聘教授徐小冬眼里，她對韓春雨能夠做出現在的工作一點也不感到奇怪，雖然韓春雨沒有海外留學經歷，但是也受到了很好的專業科學訓練。她認為，對一個受過專業科學訓練的科研工作者來說，占用資源的多少并不會決定他是否能夠做出很好的工作。

“他這個人蠻有個性，從來不是那種循規蹈矩的人，他能夠堅持一些東西，守著自己的一畝三分地，也敢于表達自己，挑戰威權……投稿能夠較這么長時間的勁，說明對自己的工作很有自信。”徐小冬說。

如今，面臨四面八方涌來的合作邀請，韓春雨統統交給沈嘯來處理。“他見識廣，也是一個好的合作者……我主要在實驗室干活，而且我也喜歡這樣的生活。”韓春雨說。

清華大學醫學院

教授 魯白

在一所不太有名的大學，我們自己培養出的科研人員也能做出這樣的成果，能夠和美國的最新技術叫板，是一件了不起的事情。NgAgo-gDNA技術的知識產權掌握在韓春雨團隊手中，目前還沒有看到有人與之競爭，這又是一大優勢。CRISPR-Cas9技術的發明者中有美國麻省理工學院的華人科學家張鋒等人，也有美國加州大學的珍妮弗·杜德納等人，由于該技術在科學上和商業上的巨大前景，雙方團隊正為這一技術的專利權歸屬打官司。我們自己掌握了知識產權，不僅有利于中國生命科學界使用這項技術，一些國外的大公司也可能會主動來付費要求得到技術授權。

現在一些科研評價體系往往是講名氣、擺資歷，不利于年輕人發揮創造性，希望能夠借韓春雨的事例，呼吁中國科學界做出體制上、文化上的突破，鼓勵年輕人冒頭創新，這也符合國家號召創新的政策。

哈佛大學分子與細胞生物系

副研究員 段昕

韓的工作把系統進一步優化，而且使得短介導DNA的準確性和識別長度有了重大突破。

我們希望看到的是更多的不同基因靶點，不同組織細胞亞型，不同的發育階段，不同的物種和不同的遞送手段（delivery method）的數據。以張鋒為代表的MIT-Broad Institute的同仁在過去五年間對于CRISPR-Cas9的改進和實驗應用方面做出了舉世矚目的貢獻。希望NgAgo的故事會是一樣的精彩激烈。這會是一場國際競賽。祝中國韓好運！

而這說明幾點：

第一，許多生物研究資源（比如NCBI包括pubmed，PDB，引物數據庫，測序，常用載體，蛋白純化方法）無論是MIT也好還是河北科大也好，都是可以獲取的，只要你有心有想法（當然需要大型儀器和經費支撐的基因組學和結構生物學另說）;

第二， 踏實勤奮其實是好的科研必要條件，現行科研體制（美國是鼻祖，中國學自美國）有些浮夸和浮躁，更像商業運營;

第三，也是我今天跟同學討論的，你所在的機構越好（比如broad或者RU這種神級機構），但作為年輕獨立PI你所付出的許多努力是在維持在這些院所的生存。我跟同學開玩笑說，你在哈佛醫學院能當一個正教授所需具備的能力可以去一個小國家當總統了，但你把這些努力用在別的地方，可能回報率更高，而不是只維系了一個在哈佛的教授頭銜。