免疫抑制治療對36例神經系統副腫瘤綜合征相關抗體定量的動態影響

姜海偉　胡晴　鄢艷紅　葛林通　高暢　曹夢瑩　劉芳　尹花

430030　武漢,湖北省第三人民醫院神經內科[姜海偉　胡晴　鄢艷紅　葛林通　高暢　曹夢瑩　劉芳　尹花]

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免疫抑制治療對36例神經系統副腫瘤綜合征相關抗體定量的動態影響

姜海偉胡晴鄢艷紅葛林通高暢曹夢瑩劉芳尹花

430030武漢,湖北省第三人民醫院神經內科[姜海偉胡晴鄢艷紅葛林通高暢曹夢瑩劉芳尹花]

【摘要】目的探討免疫抑制治療對神經系統副腫瘤綜合征(PNS)相關抗體定量的動態影響。方法對36例神經系統副腫瘤綜合征進行規范化的免疫抑制治療(包括糖皮質激素或環磷酰胺)，在治療前及治療開始后1周、4周、治療后1周，結束后3月分別對患者血清抗-Hu抗體、抗-Yo抗體、 抗-Ri抗體進行定量檢測(酶聯免疫吸附試驗,ELISA)，對比治療前后相關抗體滴度的動態變化情況。結果血清抗-Hu抗體：治療開始后1周抗體滴度即開始持續下降(P<0.01)，但在治療后3月，抗體滴度反彈升高，與治療前比較沒有明顯差異(P>0.05)。抗-Yo抗體及抗-RI抗體在治療開始后抗體滴度同樣呈持續下降趨勢，其中抗-Yo抗體治療開始后1周下降有明顯差異(P<0.01)，抗-RI抗體在治療后4周明顯下降(P<0.01)，但治療結束后1周、3月抗體滴度有所上升，但與治療前比較仍顯著下降(P<0.01)。結論免疫抑制治療在治療期間能夠一定程度上有效抑制PNS相關抗體的滴度，但對于血清抗-Hu抗體遠期抑制效果欠佳。

【關鍵詞】免疫抑制治療神經系統副腫瘤綜合征抗體定量動態作用

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.02.002

目前對神經系統副腫瘤綜合征(PNS)的治療尚無特異性方法,早期診斷早期原發癌腫切除、放療或化療可使少數PNS部分或完全緩解，但大多數有關的神經功能缺損仍需進一步治療。目前除使用改善微循環、神經營養藥物、B族維生素等治療外，以糖皮質激素、靜脈注射免疫球蛋白、免疫抑制劑等免疫治療為主，部分患者可進行血漿置換，但大多數研究表明，這些治療方法療效均不確定[1-2]，目前尚未見到有關PNS療效不確定的具體原因的相關報道，本研究自2012年開始，以“免疫治療對神經系統副腫瘤綜合征的應用”為主題，搜集病例資料進行臨床觀察，目前已經有36例患者納入觀察，通過觀察，了解免疫抑制治療對相關抗體動態的影響。

1資料與方法

1.1一般資料1)診斷要點：參考文獻全國高等學校教材(8年制及7年制臨床專業)《神經病學》(第2版)“神經系統副腫瘤綜合征”的確診標準要點[3]：(1)典型的神經綜合征且在5年內發生腫瘤(神經抗體檢查非必需)；(2)非典型的神經綜合征在對腫瘤行非免疫治療后明顯好轉，而不是自發緩解；(3)非典型的神經綜合征伴腫瘤神經抗體，并且在其后5年內發生腫瘤；(4)神經綜合征(典型或非典型)伴特征性腫瘤神經抗體陽性，但未發現腫瘤)；2)入選標準：(1)年齡20～80歲，性別不限；(2)已經確診的實體腫瘤患者經治療處于RECIST療效標準SD以上者，在原發腫瘤的治療(放療、化療等)間歇期者；(3)可耐受糖皮質激素或其他免疫抑制劑治療者，且為首次接受治療者；(4)簽署知情同意書并愿意隨訪者；3)排除標準：(1)由其他原因引起神經系統疾病不能排除者；(2)合并其他臟器功能嚴重衰竭者或造血功能嚴重障礙者；(3)合并其他自身免疫性疾病者。(4)觀察期間采用其他治療方式者，如丙種球蛋白沖擊，血漿置換可能影響抗體滴度者; 4)自2012年6月-2015年3月湖北省第三人民醫院神經內科、腫瘤科住院患者36例，其中已經發現并確診為惡性腫瘤患者31例，腫瘤神經抗體陽性但尚未發現腫瘤患者5例。31例已經發現腫瘤的患者中肺癌14例，卵巢癌3例，結腸癌4例，胃癌4例，肝癌3例,乳腺癌3例，從出現神經癥狀至發現腫瘤的時間為35 d～23個月，所有病例均經X線片、CT、MRI、纖維支氣管鏡、胃鏡等影像學或病理檢查發現腫瘤；其余5例患者，均伴有典型神經綜合征，同時腫瘤神經抗體陽性。36例患者年齡在39～73歲，平均年齡54.45±7.67歲，發病病程在3月-5年，其中周圍神經病變7例，邊緣葉腦炎7例,僵人綜合征1例，感覺神經元病1例,進行性小腦變性1例、腦干腦炎2例、重癥肌無力1例、格林巴利綜合征3例、運動神經元病2例、Lambert-Eaton肌無力綜合征2例、脊髓炎1例、皮肌炎2例，進行性多灶性白質腦病2例、門冬氨酸受體腦炎2例;5)試劑 抗Hu抗體(Catalog#：10457)、抗Yo抗體(Catalog#：10448)、抗-Ri抗體(Catalog#：10445)雙抗夾-t],ELISA試劑盒，由上海信裕生物科技有限公司提供。1.2治療及副反應針對患者個人體質及相關檢查選用糖皮質激素(主要為地塞米松、潑尼松龍、甲潑尼龍等)或免疫抑制劑(環磷酰胺)治療；療程及服用方法依據患者具體情況及臨床癥狀改善情況而定；二者根據情況連用，其中26例患者行激素沖擊療法，先靜滴甲強龍注射液(500-1000 mg/d，連用3d)或地塞米松(20-50 mg， 1次/d，連用3 d)，后改為潑尼松片劑口服(1.5～2 mgkg-1d-1，最大劑量60 mg/d,，每2周減量5 mg，減至15 mg時每3周減量5 mg，直至減完)，10例采用糖皮質激素沖擊治療后改用潑尼松片，同時聯用環磷酰胺治療(1000 mg/次，每周1次，目標劑量9000 mg，WBC<4.0×109/L停用);用藥期間監測患者血常規、血糖及相關可能的不良反應指標，同時采用相關的預防性藥物。以所有藥物停止使用作為治療終點。

1.3觀察指標患者治療前及治療開始后1周、4周、治療結束后1周， 3月血清抗-Hu抗體、抗-Yo抗體、 抗-Ri抗體的定量檢測(酶聯免疫吸附試驗,ELISA)。具體步驟為入院根據觀測時間每例患者從肘靜脈抽血2 mL，3000 r/min離心20 min，分離血清。-20 ℃保存備用。(1)標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照說明書在小試管中進行稀釋。(2)加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 uL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液4 uL，然后再加待測樣品10uL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。(3)溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。(4)配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備(5) 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干；(6)加酶：每孔加入酶標試劑50 uL，空白孔除外；(7)溫育：操作同3；(8)洗滌：操作同5。(9)顯色：每孔先加入顯色劑A 50 uL，再加入顯色劑B 50 uL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min；(10)終止：每孔加終止液50 uL，終止反應(此時藍色立轉黃色)；( 11) 測定：以空白空調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15 min以內進行。

2結果

36例患者均完成隨訪，有31例患者均完成計劃療程，3例患者在治療完成約2/3療程后腫瘤出現進展，進行其他治療，以停用時間作為治療終點。1例患者自行加快口服潑尼松片停藥速度，第17周停藥。1例患者因無法耐受環磷酰胺不良反應，第5周停用環磷酰胺，繼續口服潑尼松片完成療程。免疫抑制治療前后抗抗HU、抗RI、抗YO抗體定量檢測水平見表1。

表1　免疫抑制治療前后抗HU、抗RI、

注:與治療前比較，▲P<0.01；與治療后1周比較 ，*P<0.01。

3討論

PNS的發病是由于人體免疫系統對異位表達神經抗原的腫瘤發生免疫反應,PNS相關的免疫介導的抗體主要為抗-Hu抗體、抗-Yo抗體、抗-Ri抗體三種抗體。目前，抗體的檢測主要以間接免疫熒光方法定性檢測為主，在診斷方面定性檢測具有非常直觀的作用，但治療效果的監測過程中定性檢測很難直接反映其動態變化。有研究表明，NPS組血清抗-Hu抗體、抗-Yo抗體、 抗-Ri抗體的定量明顯高于非NPS組的腫瘤患者[4]；同時在抗Hu抗體綜合征患者的神經組織中可以檢測到免疫球蛋白的沉積，這些免疫球蛋白的一部分就包括抗Hu抗體。anti-Hu免疫球蛋白在神經系統中的特定區域(如海馬、腦干、脊髓等)表達高于其血清，相關的PNS發病與抗Hu抗體的高表達有關[5]。

本研究通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清抗-Hu抗體、抗-Yo抗體、 抗-Ri抗體的定量，同時通過免疫抑制治療觀察其抗體的動態變化。其結果顯示，在使用激素或是環磷酰胺后1周內抗HU抗體抗體即開始下降，在免疫抑制藥物使用期間，其抗體滴度呈下降趨勢，但激素停止有逐漸反彈表現，在治療結束后3月，抗-Hu抗體升高與治療結束后1周比較具有顯著差異(P<0.01)，而與治療前相比其差異已經沒有統計學意義(P>0.05)。在使用激素或是環磷酰胺后抗-Yo抗體呈緩慢下降趨勢，治療結束后4周開始顯著下降，在治療開始后1周抗Ri抗體即開始下降，二者在治療結束后其抗體定量均值雖呈上升趨勢，但與治療前相比其差異無統計學意義。本研究表明，免疫抑制性藥物對于PNS相關抗體定量具有一定的抑制作用。但對于抗HU抗體來說，有關研究表明激素或免疫調節劑對抗-HU抗體綜合征患者的臨床癥狀改善作用有限，Dalmau等進行的一項71例抗-hu抗體綜合征患者的研究發現，僅有2例患者的腦炎神經癥狀在使用皮質類固醇后改善，其余患者即使接受更高劑量的皮質類固醇及環磷酰胺和丙種球蛋白癥狀也沒有進一步改善[6]。Graus等一項200例抗-hu抗體綜合征患者的觀察中發現通過基礎的腫瘤治療后，無論是否進行免疫治療，患者的神經癥狀改善的獲益比僅為4.56%[7]。抗-hu抗體綜合征多見于小細胞肺癌患者，患者的獲益比低可能與小細胞肺癌不良的預后及較短的生存期有關[8]。本研究結果顯示，抗-Hu抗體定量在治療結束后出現明顯反彈，而抗-Yo抗體、 抗-Ri抗體定量則反彈不明顯。這就提出一個問題：臨床癥狀改善是否與抗體定量動態改變有關？由于目前病例相對較少，進行相關性研究缺乏說服力，因此本研究下一階段的內容將進一步搜集病例，進行抗體定量變化與臨床癥狀評分的相關性研究，以期回答上述問題。

同時，對于PNS來說，其臨床癥狀的影響因素及問題還有很多，如原發腫瘤是否得到良好的治療，神經系統癥狀出現的時間與免疫治療進行的時機，PNS診斷的難度，確診的時間長短等均有可能影響其臨床癥狀的變化，新發現的不同的副腫瘤綜合征有其特異性抗體，血清中的抗體滴度與腦脊液抗體滴度變化是否一致等。同時目前針對PNS的免疫治療臨床報道大多數均以回顧性報道為主，且病例較少，缺乏雙盲、隨機、對照研究。少數前瞻性研究也是以非雙盲，非對照性臨床試驗為主，且研究病例少，缺乏具有說服力的循證醫學證據的臨床研究[9-10]。

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(2015-12-16收稿)

The dynamic effects of immunosuppressive therapy on the related antibody titer for 36 cases of paraneoplastic neurological syndromes

JiangHaiwei，HuQing,YanYanhong,etal.

DepartmentofNeurology,Thirdpeople'sHospitalofHubeiProvince，Wuhan430033

【Abstract】ObjectiveTo investigate the dynamic effects of immunosuppressive therapy on the antibody titer associated with paraneoplastic neurological syndromes. Methods36 cases of paraneoplastic neurological syndromes were given standardized immunosuppressive therapy (including corticosteroids or cyclophosphamide). The serum antibodies of anti -Hu, anti -Yo and anti -Ri were quantitative detected by ELISA method before treatment，one week during treatment, four weeks during treatment，one week after treatment and three months after treatment respectively. The dynamic changes of antibody titers were compared before and after treatment. ResultsThe antibody titer of anti-Hu began to decline at one week during treatment (P<0.01), but the titer increased in three months after treatment, and there was no statistical significance compared with the titer before treatment (P>0.05). The titer of Anti -Yo and anti Ri both showed a downward trend after the beginning of treatment. The anti -Yo declined in one week and the anti - Ri declined in four weeks during treatment (P<0.01). After the end of the treatment, the titer showed an increased trend, but still significantly decreased compared with before treatment (P<0.01). ConclusionImmunosuppressive therapy can effectively inhibit the titer of antibody associated with PNS in a certain extent during the treatment, but there is not a long-term effect for Anti -Hu.

【Key words】Immunosuppressive therapyParaneoplastic neurological syndromesTiter of antibodyDynamic effects

【中圖分類號】R739.4

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2016)02-0080-04

基金項目：2015-2016年度湖北省衛生計生指導性項目(項目編號為WJ2015Z052)