BRAF 抑制劑PLX4032和放療聯合治療高級神經膠質瘤

張春滿　鄭云峰　米娟

716000　延安大學附屬醫院神經外科[張春滿(通信作者)　鄭云峰　米娟]

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BRAF 抑制劑PLX4032和放療聯合治療高級神經膠質瘤

張春滿鄭云峰米娟

716000延安大學附屬醫院神經外科[張春滿(通信作者)鄭云峰米娟]

【摘要】目的探討BRAF抑制劑PLX4032聯合放療對高級別神經膠質瘤的療效。方法選擇兩株細胞分別為AM-38(BRAF V600E)和GBM8(BRAF wildtype)，用Cell Titre Glo 方法檢測細胞的IC50；用克隆形成實驗檢測PLX4032對不同放射劑量的增敏作用；用流式細胞儀檢測PLX4032和放療對細胞凋亡和周期的作用。結果PLX4032顯著抑制BRAF V600E 細胞的增殖(IC50=2 μM)而對野生型細胞沒有作用；克隆形成實驗發現在BRAF V600E 細胞上隨著劑量增加，聯合治療組比單獨放療組的抑制作用更顯著(P<0.05)，而野生型細胞株上聯合組和單獨放療組沒有顯著性差異(P>0.05)；流式細胞分析發現在BRAF V600E突變細胞上，聯合治療組細胞凋亡數顯著增加，與對照組和單獨治療組相比有顯著差異(P<0.05)，而在野生型細胞株上沒有顯著性差異；流式分析發現在BRAF V600E突變細胞上，與對照組相比，單獨放療組和聯合治療組在G0/G1期細胞數都減少，G2/M 期細胞數增加，而且聯合治療組與單獨放療組相比有顯著差異。結論BRAF抑制劑PLX4032 與放療聯合治療BRAF V600E突變的高級別神經膠質瘤的療效較好。

【關鍵詞】BRAF抑制劑放療神經膠質瘤

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.02.007

高級神經膠質瘤(high-grade glioma，HGG)目前主要通過手術切除，然后輔以放療以及化療進行治療，這些方式在其治療上取得一定進展，延長了患者的生存期，總的中位生存期不超過15個月[1]。盡管隨著對腫瘤基因的不斷深入研究，已經為腫瘤的個體化治療開拓了新的道路，但由于腫瘤是基因異質性的，當單獨用靶向藥物進行治療時會形成耐藥，因此迫切尋找新方法來改善治療效果，特別是對于難治性神經系統惡性腫瘤[2]。

RAF在腦腫瘤的形成和治療過程中都有重要作用[3]。基因學研究表明BRAF V600E在人類腫瘤發生進展中作為癌基因發揮作用，這些腦腫瘤患者包括少量的成人腦腫瘤和6%～25%的兒科腦瘤[4]。體外研究表明RAF 的持續激活也能促進膠質瘤的形成。有一項研究報道發現BRAF V600E 突變的兒科膠質瘤比野生型兒科膠質瘤患者在治療以及預后方面表現更差[5]。大量文獻表明RAF的持續激活或者過表達在放療的響應過程中也具有重要作用[6]。

BRAF V600E抑制劑可通過抑制MAPK磷酸化從而導致細胞周期阻滯以及增加細胞凋亡[7]。FDA批準威羅替尼(PLX4032)用于靶向BRAF V600E突變的黑色素腫瘤治療[8]，而且臨床前數據表明PLX4032和放療聯合可用于治療不同腫瘤[9]。因此，本研究通過PLX4032和放療聯合治療BRAF V600E突變的腦神經膠質瘤，以期為該靶向藥物與放療聯合治療腦腫瘤能夠進入臨床應用提供依據。

1材料與方法

1.1細胞培養及突變檢測

BRAF突變和野生型細胞株為AM-38和GBM8，購自中科院上海細胞庫，用含10%FBS胎牛血清(FBS，hyclone)的DMEM培養基，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中進行培養。細胞進行BRAF基因序列的檢測，確認AM-38存在BRAF V600E突變，GBM8為野生型。

1.2細胞增殖實驗

用Cell Titre Glo試劑盒(購自Promega公司)進行檢測，細胞接種到96孔板中，每孔100 uL培養基，2000～3000個細胞數，加入不同濃度藥物進行處理72 h后每孔加入25 uL Cell Titre Glo 檢測試劑，酶標儀讀板對活細胞數進行檢測，并計算每株細胞的半數抑制濃度IC50。每個藥物濃度設置3個復孔。

1.3細胞凋亡和周期檢測

每個6 cm培養皿鋪1×106個細胞。將細胞分4組：對照組、藥物組(5 μM PLX4032)、放射組(培養6 h進行6 Gy照射后繼續培養)及聯合組(含5 μM PLX4032的培養液培養6 h進行6 Gy照射后繼續培養)；72 h后收集細胞，采用Annexin V-FITC和PI雙染細胞(BD Pharmigen TM, San Diego, CA)，流式細胞儀進行凋亡檢測；每組重復3個樣本； 24 h后收集細胞，預冷70%乙醇固定后用PBS洗滌3次，每次5 min，加100 μL含RNase A的37℃水浴30 min，加入400 μL PI染色混勻．4℃避光30 min，用流式細胞儀檢測，每組重復3個樣本，取均值。

1.4克隆形成實驗

細胞用胰酶消化處理后重懸保證形成單個細胞，將細胞接種到6孔板中，每個孔中的細胞數為500個，接種24 h 之后加入不同濃度藥物進行處理，藥物處理24 h后分別照射不同劑量治療(0、2、4、6 Gy)，每個劑量設置3個復孔；分為4組：對照組、藥物組、單純放射組以及聯合聯合組。藥物組和聯合治療組中的濃度根據細胞增殖實驗中得到的IC25(最大抑制濃度的25%)設置。每天觀察，10～14 d后，細胞數50個以上為1個克隆4% PFA固定后，結晶紫染色，對克隆數進行檢測。

1.5統計方法

2結果

2.1PLX4032對兩株細胞的抑制率

利用Cell Titre Glo試劑盒對兩株細胞PLX4032的IC50進行檢測發現，AM38 BRAFV600E突變細胞株上為(2±0.35)μM，而在GBM BRAF 野生型細胞株未檢測到(>20 μM)(表1)。

表1　BRAF突變狀態以及PLX4032在兩株細胞上的IC50

2.2PLX4032對細胞放射增敏作用

用克隆形成實驗檢測BRAF 抑制劑對放療的增敏作用，選擇PLX4032 0.5 μM與2、4、6三個不同放射劑量進行聯合，發現對于GBM6(BRAF野生型)細胞，隨著放射劑量的增加，聯合治療組和單純放療組沒有顯著性差異(P>0.05)，而對于AM38(BRAF V600E)細胞，隨著放射劑量增加，聯合治療組與單純放療組有顯著性差異(P<0.05)。

圖1 BRAF抑制劑對療效的增敏作用

2.3PLX4032對細胞凋亡作用

由圖2可以看到，在BBM6 BRAF 野生型細胞上藥物組、單純放射組以及聯合治療組對細胞凋亡沒有明顯影響(P>0.05)；在AM38BRAF V600E 突變細胞上聯合治療組與單純放療組、藥物組相比有顯著性差異(P<0.05)，聯合治療組細胞凋亡比例達到49.3%。

2.4PLX4032對細胞周期作用

流式細胞儀檢測對細胞AM38(V600E)周期的影響發現，與對照組相比，發現藥物組、單純放射組以及聯合治療組的細胞G0/G1期細胞數明顯減少(P<0.05)，聯合治療組該期細胞數最少；同時與聯合治療相比，藥物組以及單純放療組G0/G1期細胞數也有顯著性差異(P<0.05)。與對照組相比，藥物組、單純放療組以及聯合治療組G2/M 期細胞數明顯增加(P<0.05)，聯合治療組增加最明顯；與聯合治療組相比較，藥物組以及單純放療組G2/M期細胞數目也有顯著性差異(P<0.05)(表2)。

3討論

隨著科學發展證明分子通路可促進神經膠質瘤的形成，從而使得腦瘤的靶向治療已成為臨床實驗的重點[4,10]。以前的研究已經表明RAF的持續激活在放射治療中具有一定作用[5]，而且幾種新型靶向BRAFV600E抑制劑已經在臨床上得到檢驗，其中dabrafenib已被證明可通過血腦屏障有效抑制BRAF V600E突變的腦轉移瘤7,11]。放療在高級別神經膠質瘤和復發膠質瘤的治療中起著關鍵作用，對于患者的生存和預后都有重要影響[12]；體外數據也表明放療和BRAF V600E靶向抑制劑聯合具有一定協同作用以及在體內動物模型的數據也已經表明放療可以增加BRAF V600E黑色素瘤細胞株對BRAF V600E抑制劑的敏感性，同時越來越多的研究報道發現靶向藥物的耐藥性極大限制藥物在臨床上的進一步應用[13]。因此，研究RAF抑制劑和放療聯合治療BRAF V600E突變的膠質瘤具有很重要的臨床應用價值。

圖2 PLX4032和放療對細胞凋亡的影響注:與PLS+XRT(聯合治療組)比較,*P<0.05。

表2　流式細胞儀檢測細胞周期分布

注：與對照組相比，*P<0.05；與藥物組以及單純放療組比較，#P<0.05

克隆形成實驗是放射生物學檢測細胞毒性的標準方法，成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞，同時克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀[14]。本研究通過克隆形成實驗結果表明，PLX4320(一個BRAF V600E抑制劑)與放療聯合在BRAFV600E突變的神經膠質瘤細胞上具有聯合抑制作用，其中BRAF V600E抑制劑用了較低的濃度IC25，而這種聯合作用在野生型的膠質瘤細胞株上沒有作用，這一結果與在黑色素瘤細胞上的一些臨床前的數據基本一致[15]。但是該抑制劑與放療聯合作用具體是疊加還是協同本研究并沒有進一步分析，有待于下一步研究，同時對于這種聯合作用還存在著一定爭議，Dasgupta的研究結果表明BRAF抑制劑和放療在體外具有疊加作用[16-17]，而Nicolaides的研究證實在體外和體內都具有協同作用[5]。流式細胞儀分析發現聯合治療組在BRAF V600E膠質瘤細胞上顯著增加了細胞凋亡，與單獨放療組和對照組相比都具有顯著性差異，而在野生型細胞中對細胞凋亡沒有明顯作用。對于細胞周期進行分析發現，聯合治療組細胞在G2/M期細胞數明顯增加，從而表明靶向治療和放療結合可將細胞周期阻滯在G2/M期，這一結果跟另外一項研究的結果有差異，Sala等人報道發現BRAF 抑制劑和放療結合可將細胞周期阻滯在G0/G1期[18]，可能本研究與Sala等研究用的BRAF特異性抑制劑(PLX4720)不同以及用到的濃度和放射劑量不同。

BRAF V600E抑制劑PLX4032已經被FDA批準用于治療BRAFV600E突變的轉移性黑色素瘤以及GSK2118436(dabrafenib)目前也在臨床試驗階段，因此安全有效的BRAF V600E抑制劑可被臨床上用于黑色素瘤、甲狀腺瘤以及結直腸癌的治療，并且PLX4032的臨床試驗證實BRAF V600E 突變腫瘤的治療通過單一的靶向藥物治療療效并不理想。本研究結果表明放療和BRAF V600E抑制劑聯合可導致BRAF V600E細胞的周期阻滯、凋亡增加以及降低克隆形成，從而為靶向BRAF V600E這一有前景的抑制劑在臨床上能夠得到廣泛的應用提供了一定依據。

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(2015-12-09收稿)

The effect of combining BRAF inhibitor PLX4032 and radiation in advanced glioma

ZhangChunman,ZhengYunfeng,MiJuan.

DepartmentofNeurosurgery,AffiliatedHospitalofYananUniversity,Yanan716000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of BRAF inhibitor PLX4032 in combination with radiotherapy on advanced glioma. MethodsBRAF V600E-mutated cancer cell line(AM-38)and BRAFV600E wild-type cancer cell line(GBM8)were obtained. We performed cell viability assay to detect the IC50of the inhibitor PLX4032 by the Cell Titre Glo assay and clonogenic assays using combinations of radiation and PLX4032. Cell apoptosis and cell cycle were evaluated by flow cytometry. ResultsPLX4032 significantly inhibited the proliferation of BRAF V600E cells (IC50= 2 μM) and had no effect on wild-type cells. By clonogenic assay, combination group had more significant inhibitory effect than radiotherapy alone group for BRAF V600E cells with increasing dose (P<0.05), while there was no significant difference (P>0.05) on the wild-type cell lines between radiotherapy alone group and the combination group. For apoptosis, flow cytometry analysis showed that cell apoptosis proportion of combination group were significantly different compared to the control group and alone group in the BRAF V600E cells (P<0.05), whereas there's no significant differences in the wild-type cell lines. For the cell cylcle, flow analysis found that alone and combined groups have reduced the number of G0/G1 phase of the cell and caused the cell G2/M phase arrest compared to the control group in the BRAF V600E mutated cell. There were significant difference between the combination group and alone groups. ConclusionThese studies provide the pre-clinical rationale for clinical trials of concurrent radiotherapy and BRAF V600E inhibitors.

【Key words】BRAF inhibitorRadiation therapyGlioma

【中圖分類號】R739.4

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2016)02-0098-04