適于懸浮培養的半夏疏松愈傷組織誘導及增殖技術

劉貴賢， 張明生， 李小蘭， 胡珊珊，韋紅邊，高曉峰

(貴州大學 生命科學學院 貴州 貴陽 550025；山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

?

適于懸浮培養的半夏疏松愈傷組織誘導及增殖技術

劉貴賢， 張明生*， 李小蘭， 胡珊珊，韋紅邊，高曉峰

(貴州大學 生命科學學院 貴州 貴陽 550025；山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

摘要：用半夏葉片或葉柄作外植體，通過調節植物生長調節物質的種類、濃度及培養條件，以獲得適于懸浮培養的半夏疏松愈傷組織。結果表明，添加2,4-D較NAA誘導的愈傷組織疏松，將葉片接種于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L或葉柄接種于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + 蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L上誘導出的愈傷組織長勢較好且疏松，誘導率分別達到100%和95.6%，愈傷組織鮮重分別為0.932 g和0.622 g。將上述愈傷組織以MS + 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L培養基連續繼代3次，便獲得適于建立細胞懸浮培養體系的疏松愈傷組織，從而為半夏人工種子生產必須的同步化高質量人工種胚的培養提供可靠材料。

關鍵詞：半夏；愈傷組織；懸浮培養；植物生長調節物質

半夏為天南星科多年生草本植物，是我國傳統重要中藥材之一。具有燥熱化痰、降逆止嘔等功效[1]。最新研究發現，半夏對于抗生育、降血脂以及冠心病的治療等均具有一定的療效[2-3]。由于近年來對野生半夏的掠奪性挖采以及環境因素的變化，致使其自然資源銳減，市場供需矛盾突出。人工種植是解決半夏市場需求的主要途徑，但長期采用塊莖繁殖導致病害嚴重[4]、種質退化[5-7]、產量下降[8-9]等一系列問題。利用組織培養的方法培育半夏種苗、獲取無病毒植株、篩選優良種質等已有不少研究[10-13]。同時，半夏人工種子技術已成為近年來研究的熱點[14-19]，但半夏人工種子生產中人工種胚同步化及其分散的關鍵技術至今依然未能突破，其根本原因在于半夏疏松愈傷組織誘導較難，以至難以通過懸浮培養獲得單細胞或微細胞團，故不能實現人工種胚的同步化，更談不上人工種子的產業化。本研究通過對植物生長調節物質的種類、濃度及培養條件的篩選，建立了易于分散、增殖快速的半夏疏松愈傷組織培養體系，為獲得均一分散、高度同步化的半夏人工種胚提供優質材料，從而為實現半夏人工種子規模化生產提供了可靠的技術保障，為半夏藥材產業化發展奠定了良好的基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料

半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit.由貴州省赫章縣半夏藥材基地提供。

1.2研究方法

外植體處理：將半夏塊莖去皮后流水沖洗2 h，經75%的酒精消毒45 s，無菌水沖洗3～5次，再用0.1%升汞消毒8 min，無菌水沖洗3～5次，無菌濾紙吸干表面水分，接種于添加6-BA 1.0 mg/L和IBA 0.1 mg/L的MS培養基上誘導無菌苗。選擇苗齡15 d的健壯幼苗，分別切取葉片(0.5 cm × 0.5 cm)、葉柄頂端或葉柄基部(0.5 cm)作為外植體，備用。

愈傷組織誘導：分別以葉片、葉柄頂端或葉柄基部作為外植體，接種于添加不同種類及濃度的植物生長調節物質的MS培養基上(表1)。其中，DB代表2,4-D與6-BA組合，NB代表NAA和6-BA組合。每個處理接種5瓶，每瓶接種3個外植體，重復3次。定期統計愈傷組織誘導率及鮮重，同時考查愈傷組織的質地。同時，接種后每隔3 d隨機抽5瓶稱量愈傷組織鮮重，以時間為橫坐標、愈傷組織鮮重為縱坐標，制作愈傷組織生長曲線。

愈傷組織增殖：選取初代培養中相對疏松的愈傷組織進行繼代增殖培養。以誘導培養基為基礎，調整2,4-D和6-BA兩因素水平(表2)，共6個處理，每個處理5瓶，每瓶接種1 g愈傷組織，重復3次，30 d后稱量愈傷組織鮮重。

培養條件：培養基pH 5.8，培養溫度為(25±1)℃，光照強度1500～2000 lx，光照時間12 h/d。

數據處理：運用DPS v 7.05和SPSS 20.0對實驗結果進行統計學分析。

2結果與分析

2.1植物生長調節物質對半夏愈傷組織誘導的影響

不同植物生長調節物質對半夏愈傷組織的誘導率影響不大，但對愈傷組織鮮重及質地卻有顯著影響(表1和圖1)。外植體接種7 d后，開始出現灰白色愈傷組織，繼續培養，觀察到DB組合誘導的愈傷組織逐漸轉為黃色或淡黃色，質地較為疏松，無明顯分化現象；而NB組合誘導的愈傷組織逐漸轉為淡綠色進而變為綠色，質地緊密，并出現分化現象。DB組合誘導的愈傷組織增殖速率稍慢于NB組合，但其所誘導的愈傷組織疏松程度均高于NB組合，且較適合于后續繼代培養，故DB組合誘導產生的疏松愈傷組織可作為懸浮培養獲得同步化高質量人工種胚的材料；而NB組合所誘導的愈傷組織質地緊密、呈綠色，更適于分化形成無菌苗。從表1可以看出，DB組合中的處理4和處理7的愈傷組織鮮重分別達到0.622 g和0.932 g，明顯高于其余處理。就誘導率而言，DB組合除葉柄基部外，其余均達到100%；從形成愈傷組織的量上看，葉柄頂端最差(圖1 A～C)，葉柄基部較好(圖1 D～F)，葉片形成愈傷組織最多(圖1 G～I)，極差分析(表1)也證明了這一結果。在NB組合中，葉柄頂端形成愈傷組織有根的分化(圖1 J)，葉柄基部和葉片形成的愈傷組織有芽的分化(圖1 K和圖1 L)，且三者均形成質地緊密的愈傷組織。

A～C: 葉柄頂端形成的愈傷組織(A: 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L; B: 2,4-D 1.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L; C: 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L; ); D～F: 葉柄基部形成的愈傷組織(D: 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L; E: 2,4-D 1.5 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L;F: 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L; )；G～I: 葉片形成的愈傷組織(G: 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L; H: 2,4-D 1.5 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L; I: 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L;)；J～L: NB組合處理(J:葉柄頂端形成的愈傷組織；K:葉柄基部形成的愈傷組織；L:葉片形成的愈傷組織)。基本培養基均為MS+ 蔗糖 30 g/L + 瓊脂 6 g/L.

圖1不同生長調節物質對愈傷組織誘導的效果

Fig.1Induction effects of different plant

growth regulators oncallus

2.2愈傷組織繼代培養時間的確定

以生長健壯、幼嫩的半夏葉片作外植體，切成0.5 cm × 0.5 cm的小塊接種于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L培養基上，定期觀測愈傷組織的誘導和生長情況。從圖2可以看出，半夏葉片愈傷組織鮮重的增長表現出慢-快-慢的變化，呈S型曲線。前18 d愈傷組織鮮重增長緩慢，第18～36 d時增長快速，36 d后增長逐漸減慢。由于第27～30 d時愈傷組織增殖最快、疏松程度最高，故此階段為愈傷組織繼代培養的最佳時間。

圖2　半夏愈傷組織初代培養生長曲線Fig.2　Growth curve of callus primary culture

2.3半夏疏松愈傷組織增殖的條件及懸浮培養取材時間的確定

不同植物生長調節物質對半夏愈傷組織的增殖率、分化程度及質地均有不同程度的影響。從表2可以看出，處理4增殖率(以鮮重表示)極顯著高于處理1、2、3、5，呈黃色疏松狀；處理6次之，呈淡黃色疏松狀。隨著繼代次數的增加，處理4愈傷組織逐漸表現出分化現象，而處理6愈傷組織的疏松程度逐漸增大。處理6愈傷組織連續繼代3次后變為增殖極快、顏色淡黃、光澤度好、質地十分疏松的團塊，易于分散為幾個細胞聚集的小顆粒，這是作為懸浮培養獲得同步化高質量人工種胚的好材料。

表1　植物生長調節物質對半夏愈傷組織誘導的影響

續表1

處理號AB1C1B2C2愈傷組織誘導率(%)愈傷組織鮮重(g)愈傷組織質地及顏色外植體2,4-D(mg/L)6-BA(mg/L)NAA(mg/L)6-BA(mg/L)DB組合NB組合DB組合NB組合DB組合NB組合K20.44570.28380.3903K30.49840.32010.5038R0.2580.29690.2133

注：表中不同小寫字母表示有顯著差異(P<0.05)。

表2　不同植物生長調節物質對半夏愈傷組織增殖的影響

注：表中不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；“+”號數目表明愈傷組織分化程度。

3結論與討論

人工種子技術的出現為半夏規模化生產和種質提純復壯帶來了希望，而人工種胚同步化培養是該項技術的核心，也是關系到人工種子規模化生產能否實現的關鍵環節。但迄今為止，半夏人工種胚同步化技術問題仍未能解決，原因在于半夏愈傷組織質地較為致密，很難通過液體懸浮培養得以均一分散，致使愈傷組織分化產生的小塊莖(人工種胚)緊緊連接在一起，制作人工種子時須通過手工剝離而難以實現自動化高效生產。

本研究以半夏葉片或葉柄作外植體誘導產生愈傷組織，再通過調節培養基的生長調節物質配比及篩選愈傷組織繼代的適宜時期以獲得易于分散的疏松愈傷組織，最后在對疏松愈傷組織增殖速率和均一分散程度考查的基礎上確定懸浮培養的取材時間，從而為成功建立半夏同步化高質量人工種胚培養技術必不可少的懸浮細胞系提供了保障，為實現半夏人工種子產業化奠定了技術基礎。

參考文獻

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(2015年版一部)[M]. 北京: 化學工業出版社, 2015.

[2]Zhang X T, Cai Y J, Wang L J,etal. Optimization of processing technology of RhizomaPinelliaPraeparatum and its anti-tumor effect[J].AfricanHealthSciences, 2015, 15(1): 101-106.

[3]Yu H L, Zhao T F, Wu H,etal.Pinelliaternatalectin exerts a pro-inflammatory effect on macrophages by inducing the release of pro-inflammatory cytokines, the activation of the nuclear factor-κB signaling pathway and the overproduction of reactive oxygen species[J].InternationalJournalofMolecularMedicine, 2015, 36(4): 1127-1135.

[4]Hu X F, Fang Q L, Li S X,etal. Isolation and characterization of endophytic and rhizosphere bacterial antagonists of soft rot pathogen fromPinelliaternata[J].FEMSMicrobiologyLetters, 2009, 295(1): 10-16.

[5]馬小軍, 李西文, 杜鵑, 等. 加權打分法定量評價半夏種質資源的研究[J].中國中藥雜志, 2006, 31(12): 975-977.

[6]章艷玲, 李關榮, 位運糧. 中藥半夏的研究進展[J]. 中國農學通報, 2007, 23(7):163-167.

[7]楊旻, 陳科力. 半夏種質資源遺傳多樣性的SPAP分析[J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(3): 334-337.

[8]鄭永敏. 半夏產量的影響因素[J]. 現代農業科學, 2008, 15(3):17-18.

[9]李花, 張明生, 彭斯文, 等. 半夏不同種植模式的經濟效益分析[J]. 世界科學技術——中醫藥現代化, 2009, 11(4): 566-569.

[10]毛子成, 彭正松. 半夏快速繁殖體系的研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2003, 28(3): 193-195.

[11]陳亮, 許鴻源, 周鳳鈺, 等. 不同NAA和N6-BA濃度配比對半夏組織培養的生物效應[J]. 種子, 2008, 27(8):30-33.

[12]彭向前, 張文會. 半夏的分生組織培養與快速繁殖技術研究[J]. 井岡山大學學報, 2011, 32(2): 42-49.

[13]陶米林, 劉清波, 黃紅梅. 半夏組織培養體系的建立[J]. 北方園藝, 2013(4): 113-117.

[14]何奕昆, 朱長甫, 何孟元, 等. 半夏小塊莖的形態發生及人工種子制作[J]. 作物學報, 1997, 23(4): 482-487.

[15]薛建平, 張愛民, 盛瑋, 等. 半夏人工種子貯藏技術的研究[J]. 中國中藥雜志, 2005, 30(33): 1820-1823.

[16]張明生, 李花. 半夏人工種子制作技術及其萌發研究[J]. 種子, 2009, 28(11): 4-6,10.

[17]程力輝, 漆燕玲, 李玉萍. 半夏人工種子種皮基質配比對萌發率的影響[J]. 安徽農業科學, 2009, 37(14): 6433-6434, 6482.

[18]王宏霞, 蔡子平, 漆燕玲, 等. 不同包埋基質對半夏人工種子萌發率的影響[J]. 中國種業, 2011(6):59-60.

[19]申起飛, 張明生, 李立青, 等. 生長調節物質對半夏人工種胚形成的影響[J]. 山地農業生物學報, 2014, 33(3): 33-36.

Induction andmultiplication of loose callus ofPinelliaternata[Alismatales: Araceae} suitable for suspension culture

LIUGui-xian,ZHANGMing-sheng*,LIXiao-lan,HUShan-shan,WEIHong-bian,GAOXiao-feng

(CollegeofLifeSciencesGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China;KeyLaboratoryofPlantResourcesConservationandGermplasmInnovationinMountainousRegion(MinistryofEducation),Guiyang,Guizhou550025,China)

Abstract:Using Pinellia ternata leaf or petiole as explants to obtain loose callus suitable for suspension culture by adjusting the concentrations of different plant growth regulators and the culture conditions. The results showed that the callus was looser in the media containing 2,4-D than that containing NAA. The induced callus grew better and looser when leaves were inoculated on the medium made of MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 6 g/L, or petioles were inoculated on the medium consisted of MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + sucrose 30 g/L-1+ agar 6 g/L. The induction rates were 100% and 95.6%, respectively, and the callus fresh weights were 0.932 g and 0.622 g, respectively. After these calluses were continuously cultured three more times in the medium of MS + 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 6 g/L, the loose calluses were suitable for establishing cell suspension culture system. These loose calluses become the reliable materials for the necessary synchronization of artificial seeds for high quality production of artificial embryo culture of Pinellia ternata.

Key words:Pinellia ternata; callus; suspension culture; plant growth regulator

文章編號：1008-0457(2016)01-0082-04國際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.018

中圖分類號：Q945.5

文獻標識碼：A

*通訊作者：張明生，博士，教授，博士生導師，主要研究方向：植物生理生化與生物技術研究；E-mail: mszhang@guz.edu.cn。

基金項目：貴州省高層次創新型人才培養計劃(黔科合人才[2015]4031號)；貴州省中藥現代化科技產業研究開發專項項目(黔科合中藥字[2011]5065號)。

收稿日期：2015-12-12；修回日期：2016-01-25