NaCl脅迫下交替呼吸途徑對煙草懸浮細胞死亡調節作用的研究

馮漢青， 王玉佩， 王　婉， 管冬冬， 賈凌云

( 1. 西北師范大學 生命科學學院， 蘭州 730070; 2. 中國科學院近代物理研究所， 蘭州 730000； 3. 中國科學院大學， 北京 100049 )

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NaCl脅迫下交替呼吸途徑對煙草懸浮細胞死亡調節作用的研究

馮漢青1*， 王玉佩2，3， 王婉1， 管冬冬1， 賈凌云1

( 1. 西北師范大學 生命科學學院， 蘭州 730070; 2. 中國科學院近代物理研究所， 蘭州 730000； 3. 中國科學院大學， 北京 100049 )

摘要：鹽分脅迫是植物在自然環境中經常遭遇的環境脅迫因素之一，會引起植物代謝紊亂乃至細胞死亡，這嚴重限制了植物的生長、繁育和生存。交替呼吸途徑是植物較之動物獨特的線粒體呼吸途徑。該研究在煙草懸浮細胞中調查了交替呼吸途徑對NaCl脅迫引起的植物細胞死亡過程的調節作用及相應的內在機制，以及在200 mmol·L-1NaCl處理的煙草懸浮細胞中研究了交替呼吸途徑和細胞死亡發生及H2O2之間的關系。結果表明：(1)隨著NaCl處理濃度的增加，煙草懸浮細胞死亡水平逐漸增加，而交替呼吸途徑的容量也逐漸上升。(2)與NaCl處理相似，外源H2O2的處理也能導致煙草懸浮細胞死亡水平的增加。200 mmol·L-1NaCl的脅迫導致明顯的細胞死亡發生和H2O2產量的顯著性增加; 而較之200 mmol·L-1NaCl脅迫下的細胞，用水楊基氧肟酸(交替呼吸途徑的抑制劑)預處理后的細胞再置于200 mmol·L-1NaCl的脅迫下導致更高水平的細胞死亡和H2O2的產生。綜上表明，高鹽脅迫誘導了煙草懸浮細胞的交替呼吸途徑的增加，而交替呼吸途徑則可能通過抑制活性氧的產生而起到緩解細胞死亡發生的作用。

關鍵詞：交替呼吸途徑， 煙草懸浮細胞， H2O2， 細胞死亡

鹽分脅迫是植物在自然環境中所面臨的主要環境脅迫因素之一(Munns & Tester， 2008)。鹽分脅迫會導致植物離子含量的不平衡、滲透壓增加、水分缺失、氧化壓力、生長繁殖水平下降乃至細胞死亡(Hamada et al， 2001；Munns & Tester， 2008)。NaCl水平過高是造成鹽分脅迫的主要原因(潘瑞熾等，2008)。線粒體作為呼吸作用主要場所為細胞的生存發育及相關的代謝活動提供了能量。在高等植物的線粒體呼吸途徑中，除了細胞色素呼吸途徑外，還存在著交替呼吸途徑。該途徑的運行使得電子繞過了線粒體電子傳遞鏈中的復合物Ⅲ和復合物Ⅳ兩個ATP形成位點，而使得電子從UQ庫直接傳遞到氧分子(Millenaar & Lambers， 2003)。

低溫、病原菌侵染、水分缺失等環境脅迫因素均可導致植物交替呼吸途徑水平的上升，且該交替呼吸途徑的增加有助于植物抵抗上述的環境脅迫(Feng et al， 2008；Bartoli et al， 2005；Simons et al， 1999)。Smith et al(2009)和Wang et al(2010)研究發現，鹽脅迫會導致擬南芥幼苗或愈傷組織中交替呼吸途徑的增加，且鹽脅迫下交替呼吸途徑的增加能在一定程度上緩解鹽脅迫所導致的電子滲漏和生長速率的下降。而目前對于交替呼吸途徑在植物抵抗鹽脅迫中的生理學作用的認識較為有限。如鹽脅迫特別在較高的水平下，能導致植物細胞的死亡，而交替呼吸途徑是否在鹽脅迫下也能影響植物細胞死亡的發生則報道較少。基于此，本文在煙草懸浮細胞中研究了NaCl脅迫下交替呼吸途徑對植物細胞死亡的調節作用，有助于進一步認識交替呼吸途徑在逆境下的生理學作用以及植物在鹽脅迫下細胞死亡發生及調控的機理。

1材料與方法

1.1 煙草BY-2懸浮細胞培養

煙草懸浮細胞(Nicotianatabacumcv. Bright Yellow-2)由香港大學姜里文教授提供。懸浮細胞在MS(Murashige & Skoog，1962)液體培養基(pH值5.8)(Sigma-Aldrich公司)中生長，并在其中補充3%(w/v)蔗糖和0.4 mg·L-1的2，4-二氯苯氧乙酸。培養物于25 ℃、130 r·min-1的黑暗條件下振蕩培養(Nagata et al， 1981)。在7 d生長周期的時間間隔下，吸取10 mL細胞培養物，加入到100 mL的新鮮液體培養基中完成傳代培養。實驗所用細胞為轉入到新鮮培養基中4～5 d后的細胞，所有步驟均在無菌條件下完成。

1.2 細胞處理

吸取一定體積的細胞懸液，以1∶5(v/v)用去離子水稀釋并搖勻，取5 mL均勻的稀釋懸液過濾，再用去離子水洗滌過濾待用。在第一組試驗中，將細胞分別置于50、100、200和400 mmol·L-1的NaCl下處理5 h，以用去離子水處理的細胞作為對照。在第二組試驗中，將細胞用1 mmol·L-1的SHAM (水楊基氧肟酸，交替呼吸途徑的抑制劑)預處理5 h后，分別置于0或200 mmol·L-1NaCl下處理5 h，或以1 mmol·L-1SHAM的溶劑預處理細胞5 h后再置于200 mmol·L-1NaCl下處理5 h，以1 mmol·L-1SHAM的溶劑預處理細胞5 h后再置于0 mmol·L-1的NaCl下的細胞作為對照。在第三組試驗中，分別用0、50、100、200、400 mmol·L-1的 H2O2處理細胞5 h。

1.3 細胞死亡測定

細胞死亡采用伊文思藍染色法進行測定。(1)將處理后的細胞懸液搖勻，取1 mL細胞懸液于加入100 μL 0.025%(w/v)伊文思藍染液中染色8 min，之后先在1 000 r·min-1下離心1 min，去上清，再用磷酸緩沖液沖洗沉淀。(2)加入1 mL裂解液 [含1%(w/v)的十二烷基磺酸鈉(SDS)和50%(w/v)的甲醇] 在50 ℃下水浴0.5 h 以裂解細胞。(3)在8 000 r·min-1下離心10 min，取上清在595 nm處檢測吸光值，吸光值可反應細胞的死亡程度(Yang et al， 2004)。

1.4 呼吸速率測定

將處理后的細胞懸液立即置于測量杯中，利用Clark氧電極(中國科學院上海植物生理生態研究所制)測量在氰化鉀存在下細胞的耗氧速率，所得值即為交替呼吸的容量值，具體操作參照Bingham & Farrar(1989)。

1.5 H2O2含量檢測

取處理后的細胞用5%(w/v)三氯乙酸(TCA)磨樣，接著在12 000 × g條件下離心10 min。取0.9 mL上清液與0.1 mL 0.1% (w/v)硫酸鈦形成的Ti-H2O2的復合物用20% (v/v) H2SO4溶解混勻，測定光吸收值(OD405)，以H2O2標準曲線確定樣品H2O2含量(Patterson et al， 1984)。

1.6 數據分析

利用SPSS軟件對數據采用單因素方差分析，再用最小顯著差數(LSD)法進行兩兩比較和顯著性差異水平分析(P<0.05)。

2結果與分析

2.1 NaCl脅迫對煙草細胞死亡的影響

懸浮細胞經50、100、200、400 mmol·L-1的NaCl處理后細胞死亡水平顯著性增加，且細胞死亡程度隨NaCl處理濃度增大而增大(圖1)。

圖 1　NaCl脅迫對細胞死亡的誘導　細胞死亡水平的測量使用伊文思藍染色法，即通過測量在595 nm下所提染液的吸光值來反映。數值為至少3次獨立處理重復試驗的平均值±標準差。不同字母表示數值間在P<0.05水平有顯著性差異。Fig. 1　NaCl-induced cell death examination　The levels of cell death were measured using Evans blue staining assay by measuring the absorbance of extracted dye at 595 nm. Each value represents the mean ± SD of at least three experiments. The means denoted by the different letters represent significant differences at P< 0.05.

2.2 NaCl脅迫下煙草細胞交替呼吸途徑的變化

與細胞死亡的變化相似，細胞交替呼吸的容量也隨著NaCl脅迫濃度增大而不斷增大(圖2)。與對照相比，在50 和100 mmol·L-1的NaCl處理后交替呼吸的容量分別增加了1.18和1.68倍，但增加不顯著。而200和400 mmol·L-1的NaCl處理后交替呼吸的容量分別是對照的1.68倍、2.06倍和2.20倍，且均達到了顯著性差異(圖2)。

圖 2　NaCl脅迫對細胞交替呼吸途徑的影響　數值為至少3次獨立處理重復試驗的平均值±標準差。不同字母表示數值之間在P<0.05水平上具有顯著性差異。Fig. 2　Effects of NaCl stresses on the capacity of the alternative respiratory pathways　Each value represents the mean ± SD of at least three experiments. The means denoted by the different letters represent significant differences at P<0.05.

2.3 細胞死亡的發生和過氧化氫水平的上升有關

由于200 mmol·L-1NaCl導致了細胞死亡和交替呼吸途徑的顯著性上升，因此檢測200 mmol·L-1NaCl脅迫下細胞體內H2O2水平的變化以及交替呼吸途徑的抑制劑對其的影響。結果表明， 200 mmol·L-1NaCl脅迫導致細胞H2O2水平的顯著性上升(圖3)，提示鹽脅迫所導致細胞死亡的發生可能是H2O2在體內的積累或上升所致。

SHAM(水楊基氧肟酸)為交替呼吸途徑的抑制劑。與對照相比，1 mmol·L-1的SHAM的單獨處理并未對細胞H2O2水平發生顯著性影響。而細胞先經1 mmol·L-1SHAM 處理后再置于200 mmol·L-1NaCl下則使得H2O2水平顯著性高于對照，也顯著高于200 mmol·L-1NaCl脅迫下的細胞，表明SHAM對鹽脅迫下H2O2的產生有促進作用。

進一步用不同濃度外源H2O2對細胞進行處理，處理濃度依次為50、100、200、400 mmol·L-1。結果表明，H2O2的處理導致了細胞死亡的發生，且細胞死亡程度隨H2O2濃度的增大而逐漸增大，分別為對照組的1.34、1.6、2.5和4.07倍(圖4)，表明了細胞死亡能夠被H2O2所誘導。

圖 3　不同處理對煙草BY-2懸浮細胞H2O2水平的影響　將細胞分別置于1 mmol·L-1 的SHAM (SHAM)或200 mmol·L-1的NaCl (NaCl)下；或先經1 mmol·L-1的SHAM 處理后再置于200 mmol·L-1 NaCl下(SHAM+NaCl)。以1 mmol·L-1 SHAM的溶劑處理后的細胞置于0 mmol·L-1的NaCl下的細胞作為對照(Control)。數值為6次獨立處理重復試驗的平均值±標準差。不同字母表示數值之間在P<0.05水平上具有顯著性差異。Fig. 3　Effects of different treatments on the levels of hydrogen peroxide (H2O2) of tabacoo BY-2 suspension cells　The cells were treated as follows: the cells were respectively exposed to 1 mmol·L-1 SHAM (SHAM)， 200 mmol·L-1 NaCl (NaCl). Or， the cells were pretreated with 1 mmol·L-1 SHAM and then subjected to 200 mmol·L-1 NaCl (SHAM+NaCl). The cells pretreated with the solvent of 1 mmol·L-1 SHAM and then subjected to 0 mmol·L-1 NaCl were used as control (Control). Each value represents the mean ± SD of six experiments. The means denoted by the different letters represent significant differences at P<0.05.

圖 4　過氧化氫(H2O2)對煙草BY-2懸浮細胞細胞死亡的誘導　細胞的死亡水平的測量使用伊文思藍染色法，即通過測量在595 nm下所提染液的吸光值來反映。數值為至少3次獨立處理重復試驗的平均值±標準差。不同字母表示數值之間在P<0.05水平上具有顯著性差異。Fig. 4　Hydrogen peroxide (H2O2)-induced cell death examinationof tabacoo By-2 suspension cells　The levels of cell death were measured using Evans blue staining assay by measuring the absorbance of extracted dye at 595 nm. Each value represents the mean ± SD of at least three experiments. The means denoted by the different letters represent significantly differences at P< 0.05.

2.4 交替呼吸途徑對NaCl脅迫下細胞死亡發生的調節作用

1 mmol·L-1的SHAM處理并未對細胞H2O2的水平發生顯著性影響(圖3)；而1 mmol·L-1的SHAM對鹽脅迫下H2O2的產生具有促進作用(圖3)。相似地，對細胞單獨用1 mmol·L-1的SHAM處理并未對細胞的死亡水平發生顯著性影響(圖5)，表明在未受到NaCl脅迫的條件下，交替呼吸途徑的抑制不會對H2O2和細胞活力的水平產生影響。而較之200 mmol·L-1的NaCl的單獨處理，細胞先經1 mmol·L-1的SHAM 處理后再置于200 mmol·L-1NaCl下則導致了細胞死亡程度的進一步上升(圖5)。這些結果說明了在鹽脅迫下，抑制交替呼吸的活性，可以產生更多的過氧化氫并加劇細胞死亡程度。

圖 5　不同處理對煙草BY-2懸浮細胞細胞死亡水平的影響　將細胞分別置于1 mmol·L-1 的SHAM (SHAM)或200 mmol·L-1的NaCl(NaCl)下；或先經1 mmol·L-1的SHAM 處理后再置于200 mmol·L-1 NaCl下(SHAM+NaCl)。以1 mmol·L-1 SHAM的溶劑處理后的細胞置于0 mmol·L-1的NaCl下的細胞作為對照(Control)并以對照值設為1.0。數值為至少3次獨立處理重復試驗的平均值±標準差。不同字母表示數值之間在P<0.05水平上具有顯著性差異。Fig. 5　Effects of different treatments on the death levels of tabacco BY-2 suspension cells　The cells were treated as follows: the cells were respectively exposed to 1 mmol·L-1 SHAM (SHAM)， 200 mmol·L-1 NaCl (NaCl). Or， the cells were pretreated with 1 mmol·L-1 SHAM and then subjected to 200 mmol·L-1 NaCl (SHAM+NaCl). The cells pretreated with the solvent of 1 mmol·L-1 SHAM and then subjected to 0 mmol·L-1 NaCl were used as control (Control) and the values in the control were set to 1.0. Each value represents the mean ± SD of at least three experiments. The means denoted by the different letters represent significantly differences at P<0.05.

3討論與結論

本研究發現，NaCl的處理導致了植物細胞死亡的發生。通常來講，細胞死亡水平的增加會導致細胞代謝水平的下降；然而，細胞交替呼吸途徑的水平卻隨著細胞死亡水平的增加而不斷上升，這提示交替呼吸途徑可能是細胞抵御外界鹽脅迫的一種生理學反應。

鹽脅迫會導致植物活性氧水平的上升(Hessini et al， 2009；Skopelitis et al， 2006)。在細胞產生的活性氧當中，H2O2具有最長的半衰期；同時，由于H2O2的弱極性，其還具有穿膜的功能(Dat et al，2000)。本研究測量了200 mmol·L-1的 NaCl脅迫下細胞的H2O2水平的變化，發現該水平的NaCl脅迫誘導了細胞明顯的H2O2的產生。Maxwell et al(1999)發現，在非光合組織或器官當中，植物活性氧產生的主要位點是線粒體。由于本實驗采用的Bright Yellow-2煙草懸浮細胞也是無法進行光合作用的細胞，故推測NaCl脅迫下產生的H2O2也主要來自于線粒體。本研究進一步調查了細胞H2O2水平的增加是否能夠引起細胞死亡，結果表明，H2O2可以以劑量依賴的方式誘導細胞死亡的發生。同時，已有報道H2O2等活性氧水平的增加會對蛋白質等生物分子造成的損傷，同時又可以以信號分子的方式引發程序化細胞死亡相關基因的表達(Dat et al，2000；Rhoads et al，2006)。因此，我們認為H2O2的產生可能是NaCl脅迫下細胞死亡發生的重要原因。

本研究表明，1 mmol·L-1的SHAM單獨處理細胞并不會影響細胞的生存活力；相比于200 mmol·L-1NaCl單獨處理，細胞先經1 mmol·L-1的SHAM 處理后再置于200 mmol·L-1NaCl下則導致了更高水平的細胞死亡，說明在NaCl的脅迫下交替呼吸途徑的增加能夠緩解細胞死亡的發生；與細胞死亡的變化相似的是SHAM也導致了200 mmol·L-1NaCl的脅迫下H2O2水平的進一步上升，說明NaCl的脅迫下交替呼吸途徑的增加能夠降低H2O2的產生。交替呼吸途徑是線粒體中的一條電子傳遞途徑，該途徑的運行可以通過降低線粒體電子傳遞鏈的過度還原而限制線粒體活性氧的產生(Maxwell et al，1999)。線粒體活性氧既是NaCl脅迫下細胞H2O2產生的主要位點，又是NaCl脅迫下細胞死亡發生的重要原因。因而，本研究認為在NaCl的脅迫下，植物細胞交替呼吸途徑的抑制會導致更多活性氧的產生，從而加劇了細胞死亡的發生。故而交替呼吸途徑可能是植物在NaCl脅迫下維持細胞活力的生理學機制之一。

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Notes on taxonomy ofAristolochiaimpressinervisC. F.

Liang (Aristolochiaceae) from Vietnam Do Van Truong

(DepartmentofBiology，VietnamNationalMuseumofNature，VietnamAcademyofScienceandTechnology， Hanoi Vietnam )

Role of the alternative respiratory pathway in mediating the cell death induced by NaCl stress on tobacco suspension cells

FENG Han-Qing1*， WANG Yu-Pei2，3， WANG Wan1， GUAN Dong-Dong1， JIA Ling-Yun1

( 1.CollegeofLifeSciences，NorthwestNormalUniversity， Lanzhou 730070， China; 2.InstituteofModernPhysics，ChineseAcademyofSciences， Lanzhou 730070， China; 3.UniversityofChinaAcademyofSciences， Beijing 100049， China )

Abstract:Soil salinity stress is the one of the most widespread environmental stresses that growing plants have to frequently face. The effects of salinity stress on plants are generally associated with the disruption of metabolism. In particular， high level of salt stress can cause cell death. This seriously limits the development， growth， survival， and productivity of plants. The alternative respiratory pathway is a plant-specific respiratory pathway， which does not exist in animals. By using tobacco suspension cells， the present work investigated whether the alternative respiratory pathway could play a role in mediating the high-salt-induced death of plant cells. And， the possible mechanism for this function of the alternative respiratory pathway was also studied. The results showed that with the increase of the concentrations of NaCl， the levels of cell death of tobacco suspension cells increased， and the increased levels of cell death were followed with the increases of the capacity of the alternative respiratory pathway. Similar to the treatment with NaCl， the treatment with exogenous hydrogen peroxide (H2O2) also induced an increase in the level of cell death. The relationship among the alternative respiratory pathway， cell death， and H2O2 production was studied in the tobacco suspension cell subjected to 200 mmol·L-1NaCl. The treatment with 200 mmol·L-1NaCl caused an obvious increase of cell death and a significant enhancement of the H2O2 production. The 200 mmol·L-1NaCl-stressed cells pretreated with salicylhydroxamic acid， a specific inhibitor of the alternative respiratory pathway， exhibited higher levels of cell death and H2O2 production than the tobacco suspension cells subjected to 200 mmol·L-1NaCl stress alone. These results suggest that high salt stress can induce an increase of the alternative respiratory pathway， which plays a role in alleviating cell death under high salt stress. And， this function of the alternative respiratory pathway may relate to its ability to limit the generation of H2O2. Aristolochia impressinervis C. F. Liang was regarded as an endemic species to Guangxi Zhuang Autonomous Region，China. This species is here reported as the first record for the flora of Vietnam. Notes on taxonomy and distinguishable discussion from A. pierrei L. are also provided.

Key words:alternative respiratory pathway， tobacco suspension cells， hydrogen peroxide， cell death Aristolochiaceae， Aristolochia impressinervis， A. pierrei， new record， Vietnam

中圖分類號：Q945.3

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)04-0425-05

*通訊作者

作者簡介：馮漢青(1978-)，河北保定市人，博士，副教授，主要從事植物生理學研究，(E-mail)fenghanq@nwru.edu.cn。

基金項目：國家自然科學基金(31260059；30900105)；教育部科學技術研究重點項目(211190)；甘肅省財政廳高校科研基本業務費[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31260059；30900105); Key Program for Science and Technology Research from Ministry of Education(211190); Basic Research Foundation for Colleges and Universities of Gansu Department of Finance]。

*收稿日期:2014-10-07修回日期： 2015-03-02

DOI:10.11931/guihaia.gxz201405016 10.11931/guihaia.gxzw201504041Do Van Truong. 越南馬兜鈴屬植物分布新記錄——凹脈馬兜鈴[J]. 廣西植物，2016，36(4)：503-506

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