中國黃淮麥區(qū)菲利普孢囊線蟲淮陽和博愛致病型群體特異性SCAR標記的建立

徐 姣，劉 佳，代君麗，李洪連

(河南農業(yè)大學植物保護學院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

?

中國黃淮麥區(qū)菲利普孢囊線蟲淮陽和博愛致病型群體特異性SCAR標記的建立

徐 姣，劉 佳，代君麗，李洪連

(河南農業(yè)大學植物保護學院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

摘要：菲利普孢囊線蟲(Heterodera filipjevi)是在我國黃淮麥區(qū)新發(fā)現(xiàn)的小麥病原線蟲，其致病力更強，危害更嚴重，對小麥產量和質量造成潛在威脅。病原致病型鑒定對抗病品種的篩選和培育十分重要。為了建立一套簡便、快速、準確的SCAR標記檢測體系，以黃淮麥區(qū)5個重要禾谷孢囊線蟲致病型共9個群體為材料，首先對其進行RAPD分析，然后在RAPD分析的基礎上對其進行SCAR分析。結果表明，通過篩選97條隨機引物，獲得2個菲利普孢囊線蟲淮陽和博愛致病型群體特異的RAPD標記，其中，引物S232擴增出的多態(tài)性條帶大小為550 bp，引物S278擴增出的多態(tài)性條帶大小為1 700 bp。其后將引物S232擴增的條帶進行回收、克隆及測序，根據測序結果設計的特異性引物F232-8-1/R232-8-1僅在菲利普孢囊線蟲淮陽和博愛致病型群體中擴增出大小為517 bp的特異性條帶，而在小麥孢囊線蟲其他致病型群體中沒有擴增出該條帶，說明菲利普孢囊線蟲淮陽和博愛致病型群體SCAR標記成功建立，并將其命名為SC-S232。

關鍵詞：小麥；菲利普孢囊線蟲；致病型；分子檢測

禾谷類作物孢囊線蟲病是世界性的植物寄生線蟲病害，起初認為只危害溫帶禾谷類作物，現(xiàn)已蔓延危害生長在不同溫度帶、各種土質的禾谷類作物[1]，成為威脅小麥安全生產的一類重要病害。禾谷孢囊線蟲組是個復合種群，由12個正式定名的種和幾個未定名的種組成，其中禾谷孢囊線蟲(Heteraderaavenae)、菲利普孢囊線蟲(H.filipjevi)和麥類孢囊線蟲(H.latipons)被認為是危害最嚴重的三個種，并且有時這三種線蟲會同時存在[2-5]。禾谷孢囊線蟲病于1874年首次在德國發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已遍布50多個國家[6]。我國于1989年在湖北天門初次發(fā)現(xiàn)該病[7]，目前已在湖北、河南、陜西、甘肅、江蘇、寧夏、山東、內蒙、天津、青海、安徽、新疆、西藏、河北、山西和北京16個省(市)發(fā)生[8-18]。該線蟲病在河南省發(fā)生普遍且嚴重，除了南陽和信陽外，其他16個市小麥均發(fā)生該病，嚴重危害當地小麥生產。2010年，Peng等[19]和Li等[20]在河南省許昌市首次發(fā)現(xiàn)菲利普孢囊線蟲，隨后在該省7個地市發(fā)現(xiàn)該線蟲種。目前，菲利普孢囊線蟲的發(fā)生和分布僅在河南地區(qū)有公開報道，同時河南省也是燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲混合發(fā)生的唯一省份。

小麥孢囊線蟲病是一種土傳病害，在中國發(fā)生面積較廣，給防治帶來很大挑戰(zhàn)。郝 瑞等[21]用甘農種衣劑Ⅲ號在小麥種植前對種子進行包衣處理，能有效減少小麥根際周圍土壤中禾谷類作物孢囊線蟲(Cereal cyst nematode，CCN)的數量，但是目前高效低毒殺線蟲制劑的成本較高，在推廣應用的過程中會受到一定的限制；Singh等[22]發(fā)現(xiàn)通過休耕，在CCN沒有寄主的條件下，燕麥孢囊線蟲(H.avenae)自發(fā)孵化造成幼蟲死亡，能使其數量每年降低70%～80%，但在眾多國家和地區(qū)，因受各種因素的限制，加上土地閑置會引起難以估計的經濟損失，所以這種防治方式并不現(xiàn)實；張樹武等[23]研究發(fā)現(xiàn)，長枝木霉分生孢子懸浮液對CCN的致死作用較強，對CCN具有生防潛力，但是現(xiàn)在多數小麥CCN的生防真菌還沒研發(fā)成生防制劑，還未在生產上應用。當前，種植抗病品種被認為是防治CCN的有效途徑。要合理利用抗病品種，認識病原線蟲的種類和致病型就顯得尤為重要。根據形態(tài)學特征和依靠鑒別寄主進行鑒定，不僅費時費工，而且難以鑒別和區(qū)分近似種、生理小種間的差異。

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，應用分子標記技術鑒別線蟲種類和致病型成為一種趨勢。RAPD技術是由Williams等[24]和Welsh等[25]于1990年發(fā)展起來的分子標記技術，與其他技術相比，該技術具有操作簡單、實驗周期短、不需要知道目的基因序列、所需樣品量少和引物具有普遍性等優(yōu)點，目前已成功應用于植物寄生線蟲屬內不同種及種內群體的鑒定[26]。Caswell-Chen等[27]運用RAPD技術成功區(qū)分了甜菜孢囊線蟲(H.schachtii)和十字花科孢囊線蟲(H.cruciferae)。Lopez-Braiia等[28]對采集自多個國家的11個禾谷孢囊線蟲群體進行了RAPD分析，成功將這11個群體分為H.avenae和Gotland strain兩大種族。鄭經武等[29]利用RAPD技術分析了中國農林業(yè)生產上重要的四種植物線蟲的遺傳差異，并獲得了燕麥孢囊線蟲種的特異性分子標記。劉 佳等[30]采用RAPD技術對黃淮麥區(qū)的小麥孢囊線蟲進行了分析，并獲得了禾谷孢囊線蟲滎陽致病型群體的RAPD標記。SCAR技術最初是由RAPD技術發(fā)展而來，和RAPD標記相比較，它的引物更長并且能夠和模板完全互補，這樣擴增結果更加穩(wěn)定，重復性更強。Meng等[31]成功地將南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)及爪哇根結線蟲(M.javanica)特異的RAPD標記轉化成為SCAR標記。Ou等[32]采用RAPD-SCAR標記技術得到了大豆孢囊線蟲的特異性SCAR標記。Adam等[33]利用SCAR技術成功區(qū)別開了根結線蟲屬的7個種群。亓曉莉等[34]開發(fā)了禾谷孢囊線蟲的RAPD標記，并轉化為穩(wěn)定的SCAR標記，所獲得的SCAR標記能夠對禾谷孢囊線蟲進行準確靈敏的檢測。

以前的大量研究采用不同的分子生物學技術對植物寄生線蟲的不同種進行分子鑒定，但是很少有借助分子手段對種下不同致病型或生理小種進行鑒定的報道。2010年，Peng等[19]和Li等[20]采用形態(tài)學結合分子生物學方法，首次報道在中國引起小麥孢囊線蟲病的病原線蟲除了燕麥孢囊線蟲外，還有菲利普孢囊線蟲。通過本實驗室近年的研究發(fā)現(xiàn)，在中國黃淮麥區(qū)存在禾谷孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲多種致病型混合侵染危害小麥的現(xiàn)象[35-39]。傳統(tǒng)的致病型鑒定方法周期太長，而且結果易受主客觀因素的影響。鑒于此，本研究擬采用RAPD與SCAR標記技術，以黃淮麥區(qū)已明確致病型的9個小麥孢囊線蟲群體為研究對象進行研究，以期建立一套簡便、快速和準確的SCAR標記檢測體系，為小麥孢囊線蟲病的有效防控奠定基礎。

1材料與方法

1.1材 料

本研究共收集了9個地區(qū)土樣，具體地理位置及各個地理位置所含有的線蟲種類信息見表1。這9個小麥孢囊線蟲群體可分為5個致病型，其中，禾谷孢囊線蟲包括3個致病型：(1)河南滎陽致病型，(2)河北保定和河南商丘致病型，(3)河南安陽、河南清豐和河南杞縣致病型；菲利普孢囊線蟲包括2個致病型：(1)河南許昌致病型，(2)河南淮陽和河南博愛致病型。7月下旬到8月初，從發(fā)病CCN小麥田挖取足量小麥根際周圍的土壤，過篩(20目在上，60目在下)，將60目上的孢囊和有機質混合物晾掉過多水分后放到75%蔗糖溶液中充分攪拌，用紗布收集漂浮在蔗糖溶液上面的孢囊，放在清水中反復沖洗，將獲得的孢囊晾干，在體視鏡下用挑針慢慢的挑取孢囊，每個群體選取40個左右孢囊，進行單孢囊的擴繁，備用。

1.2方 法

1.2.1單孢囊DNA的提取

采用蛋白酶K-buffer法[24]提取單孢囊DNA，用紫外分光光度計測DNA的濃度和純度，并稀釋至50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　采集樣品的地理位置及其所含線蟲種類信息表

1.2.2RAPD標記的建立

擴增所用的97條RAPD隨機引物均由上海生工生物工程公司合成，2×TaqPCR Master Mix購自萊楓生物工程公司。反應體系(20 μL)：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，RAPD引物(10 μmol·L-1)1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，36 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在EB中染色，然后用凝膠成像系統(tǒng)Ingenius LHR despodch記錄并分析RAPD譜型。

1.2.3SCAR標記的建立

用快速型瓊脂糖DNA回收試劑盒Ⅱ型(BioTeKe公司)對隨機引物S232擴增的特異性RAPD條帶進行切膠、回收純化后，將純化產物與pMD19-T載體(TaKaRa公司)連接，并轉入DH5α感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術有限公司)。經培養(yǎng)后，采用菌落PCR鑒定陽性克隆，并將陽性克隆委托上海生工生物工程公司測序。測序結果經比對分析，設計引物 F232-8-1/R232-8-1(F232-8-1:5′-CCACTCTATAGGATTGCCAT TG-3′; R232-8-1: 5′-CCACTTCCGTAGTTTT CTCA-3′)，對孢囊線蟲的DNA進行特異性擴增，反應體系(20 μL)：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)232-8-1(5 μmol·L-1)1 μL，R232-8-1(5 μmol·L-1)1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR擴增產物按1.2.2中所述方法電泳、記錄。

2結果與分析

2.1RAPD標記的建立

1～9分別代表滎陽、保定、商丘、安陽、清豐、杞縣、許昌、淮陽和博愛小麥孢囊線蟲群體；M：DL2000(TaKaRa公司)；箭頭所示為特異性條帶。圖2和圖5中同

1～9 indicate cereal cyst nematode populations from Xingyang,Baoding,Shangqiu,Anyang,Qingfeng,Qixian,Xuchang,Huaiyang and Boai,respectively; M:DL2000(TaKaRa company)；Arrow shows specific band.The same as in Fig.2 and Fig.5

圖1隨機引物S232對5個致病型9個小麥孢囊線蟲群體的擴增結果

Fig.1PCR products of 5 pathotypes amplified from 9 cereal cyst nematode populations

with random primer S232 separated on ethidium bromide-stained 1% agarose gel

利用97條RAPD隨機引物對黃淮麥區(qū)5個致病型共9個小麥孢囊線蟲群體進行PCR擴增，每條引物至少重復擴增3次，結果發(fā)現(xiàn)，有90條引物在5個不同致病型中具有多態(tài)性，可擴增出條帶清晰、多態(tài)性好的條帶。其中，2條引物能對黃淮麥區(qū)5個致病型共9個小麥孢囊線蟲群體擴增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。引物S232(5′-ACCC CCCACT-3′)和引物S278(5′-TTCAGGGCAC-3′)擴增出了淮陽和博愛致病型群體特異性條帶(圖1、圖2)，大小分別為550 bp和1 700 bp。為消除個體的差異，隨機挑取淮陽和博愛致病型群體各3個單孢囊純系進行驗證，結果(圖3、圖4)顯示，這2個引物均能擴增出相同的淮陽和博愛致病型群體特異性條帶，和前述PCR擴增結果一致，說明這兩個RAPD標記確實是淮陽和博愛致病型群體的特異性分子標記。

2.2SCAR標記的建立

將隨機引物S232擴增的特異性RAPD條帶進行回收，克隆后送菌液到上海生工公司進行測序，測序結果顯示，引物S232擴增出的淮陽和博愛群體的特異性條帶大小為517 bp，Blast比對，序列覆蓋率(Query coverage)在4%～14%之間，在NCBI數據庫沒有發(fā)現(xiàn)任何同源序列。

依據測序結果設計特異性引物F232-8-1/R232-8-1，對線蟲DNA進行PCR擴增。結果表明，引物F232-8-1/R232-8-1可以從淮陽和博愛致病型群體中擴增出大小為517 bp的條帶(圖5)，而黃淮麥區(qū)其他致病型群體中沒有擴增出此特異性條帶。說明該引物是菲利普孢囊線蟲淮陽和博愛致病型群體的特異性引物，即菲利普孢囊線蟲淮陽和博愛致病型群體特異性SCAR標記成功建立，并將其命名為SC-S232。

圖2　隨機引物S278對5個致病型9個小麥孢囊線蟲群體的擴增結果

1～3: 淮陽小麥單孢囊線蟲；4～6：博愛小麥單孢囊線蟲；M：DL2000(TaKaRa公司)；箭頭所示為特異性條帶。圖4中同

1～3 indicate 3 cysts from pure lines of Huaiyang population; 4～6 indicate 3 cysts from pure lines of Boai population; M: DL2000(TaKaRa company);Arrow shows specific band.The same as in Fig. 4

圖3隨機引物S232對隨機挑取的淮陽和博愛小麥孢囊線蟲群體各3個單孢囊純系的擴增結果

Fig.3PCR products of single-cyst DNA amplified with random primer S232 from the respective

three samples collected from Huaiyang,and Boai in Henan Province

圖4　隨機引物S278對隨機挑取的淮陽和博愛小麥孢囊線蟲群體各3個單孢囊純系的擴增結果

3討 論

目前在我國小麥禾谷孢囊病引起的小麥危害面積已達333萬hm2以上，嚴重地塊損失率可高達70%以上，已經成為我國小麥生產中的一個重要問題[40]。本研究選取的線蟲群體基本上覆蓋了黃淮麥區(qū)重要的小麥孢囊線蟲發(fā)生地區(qū)，建立孢囊DNA的分子檢測方法，與傳統(tǒng)鑒定方法相比，可大大縮短鑒定時間，而且使鑒定結果更加可靠，簡單快捷，靈敏度高，有助于提高檢測效率。

10：陰性對照Negative control

圖5引物F232-8-1/R232-8-1對5個致病型9個小麥孢囊線蟲群體的擴增結果

Fig.5PCR products of 5 pathotype amplified from 9 cereal cyst nematode

populations with specific marker F232-8-1/R232-8-1

RAPD技術具有豐富的多態(tài)性和易操作性，因此它適合于檢測種及其以下水平的多樣性，但是，RAPD技術穩(wěn)定性和重復性差，需要進行大量的預實驗進行RAPD反應體系和反應程序的優(yōu)化，為了便于在實際運用中推廣，本研究將RAPD標記轉化為更穩(wěn)定的SCAR標記。本研究中獲得了2個菲利普孢囊線蟲淮陽和博愛致病型群體相關的RAPD標記，但只有S232擴增出的RAPD標記成功轉化為SCAR標記，而S278擴增出的RAPD標記沒有轉化成SCAR標記，分析SCAR標記轉化失敗的原因可能跑電泳樣品間污染造成。實驗中利用DNAMAN軟件對S278特異性條帶序列設計了5對SCAR標記引物，但依然沒有特異性，推測特異性條帶表現(xiàn)的不是其在致病型間的差異。

菲利普孢囊線蟲種的分子鑒定，已有很多研究報道，多是采用不同的限制性內切酶酶切線蟲的rDNA-ITS序列，來區(qū)分不同的線蟲種類[41-46]。Peng等[47]開發(fā)了菲利普孢囊線蟲種特異性的SCAR標記，并對所找到的SCAR標記的檢測靈敏度進行了相關研究，發(fā)現(xiàn)所找到的SCAR標記對2齡幼蟲裂解物的檢測靈敏度可以達到0.125 μL，對雌成蟲裂解物的檢測靈敏度可達到3.9×10-3μL。Toumi等[48]根據菲利普孢囊線蟲的COI基因設計引物從Heterodera屬的混合群體中特異性的檢測出菲利普孢囊線蟲，檢測靈敏度達到5條線蟲。但是已有的研究報道多是針對植物寄生線蟲不同種的分子檢測和鑒定，很少有將研究目標對準種下生理小種或致病型的分子檢測和鑒定。本實驗室將通過擴大引物的篩選范圍，來獲得更多的致病型相關的分子標記，并通過收集更多的菲利普孢囊線蟲和禾谷孢囊線蟲致病型群體來檢測所獲得標記的特異性和有效性；另一方面還需要拓寬思路為致病型的分子檢測探索出更簡便快捷的技術和方法，將小麥孢囊線蟲的致病型分子檢測體系和傳統(tǒng)的致病型鑒定方法相結合，建立一套完整的小麥孢囊線蟲致病型檢測體系，為抗病品種的選育和合理布局提供科學依據。

參考文獻：

[1]Riley I T,Nicol J M,Dababat A A.Cereal cyst nematodes:status,research and outlook [C]//Proceedings of the First Workshop of the International Cereal Cyst Nematode Initiative,Antalya,Turkey,2009:21-23.

[2]Yan G P,Smiley R W.DistinguishingHeteroderafilipjeviandH.avenaeusing polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism and cyst morphology [J].Phytopathology,2009,100:216-224.

[3]Abidou H,El-Ahmed A,Nicol J M,etal.Occurrence and distribution of species of theHeteroderaavenaegroup in Syria and Turkey [J].NematologiaMediterranea,2005,33:195-201.

[4]Toumi F,Hassan G,Waeyenberge L,etal.Distribution of cereal cyst nematodes(Heteroderaspp.) in wheat and barley fields in northeastern regions of Syria [C]//Proceedings of the Third Workshop of the International Cereal Cyst Nematode Initiative,Adana,Turkey,2012:310.

[5]Rivoal R,Nicol J M.Past research on the cereal cyst nematode complex and future needs [C]//Cereal Cyst Nematodes:Status,Research and Outlook,Ankara,Turkey,2009:3-10.

[6]Maafi Z T,Nicol J M,Kazemi H.Cereal cyst nematodes,root rot pathogens and root lesion nematodes affecting cereal production in Iran [C]//Cereal Cyst Nematodes:Status,Research and Outlook,Ankara,Turkey,2009:51-55.

[7]陳品三,王明祖,彭德良.我國小麥禾谷孢囊線蟲的發(fā)現(xiàn)與鑒定初報 [J].中國農業(yè)科學,1991,24(5):89-91.

Chen P S,Wang M Z,Peng D L.Preliminary report of identification on cereal cyst nematode of wheat in China [J].ScientiaAgriculturaSinica,1991,24(5):89-91.

[8]王振躍,王守正,李洪連,等.河南省小麥孢囊線蟲病的初步研究 [J].華北農學報,1993,8(s):105-109.

Wang Z Y,Wang S Z,Li H L,etal.A preliminary study on wheat cyst nematode diseasa in Henan province [J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,1993,8(s):105-109.

[9]趙 杰,鈕緖燕,張管曲,等.陜西省中南部地區(qū)小麥禾谷孢囊線蟲的發(fā)生與分布 [J].西北農業(yè)學報,2011,20(6):181-185.

Zhao J,Niu X Y,Zhang G Q,etal.Occurrence and distribution of cereal cyst nematode in central-south Shaanxi province [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidenalisSinica,2011,20(6):181-185.

[10]葉文興,徐炳良,彭德良,等.甘肅省小麥禾谷孢囊線蟲rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3區(qū)序列特征及ITS-RFLP分析 [J].植物保護,2010,36(3):58-65.

Ye W X,Xu B L,Peng D L,etal.Sequence and RFLP analysis of rDNA-ITS and 28S rDNA-D2/D3 regions ofHeteroderaavenaeon wheat from Gansu province in China [J].PlantProtection,2010,36(3):58-65.

[11]王 暄,梁中偉,裴世安,等.江蘇省小麥禾谷孢囊線蟲群體核糖體rDNA-ITS區(qū)序列分析 [J].南京農業(yè)大學學報,2010,33(6):55-62.

Wang X,Liang Z W,Pei S A,etal.Sequences analysis of rDNA-ITS region of cereal cyst nematodes on wheat from Jiangsu province [J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity,2010,33(6):55-62.

[12]黃文坤,葉文興,王高峰,等.寧夏地區(qū)禾谷孢囊線蟲的發(fā)生與分布 [J].華中農業(yè)大學學報,2011,30(1):74-77.

Huang W K,Ye W X,Wang G F,etal.Occurrence and distribution ofHeteroderaavenaeWollenweber in Ningxia Hui Autonomous Region [J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity,2011,30(1):74-77.

[13]楊遠永,趙洪海,彭德良.小麥禾谷孢囊線蟲在山東省的分布報道 [J].青島農業(yè)大學學報:自然科學版,2010,27(1):17-20.

Yang Y Y,Zhao H H,Peng D L.New distribution report of cereal cyst nematode on wheat in Shandong province [J].JournalofQingdaoAgriculturalUniversity:NaturalScience,2010,27(1):17-20.

[14]陳 新,周洪友,馬 璽.內蒙古中西部地區(qū)小麥禾谷孢囊線蟲的發(fā)生分布 [J].植物保護,2009,35(5):114-117.

Chen X,Zhou H Y,Ma X.Distribution ofHeteroderaavenaein the middle and west regions of Inner Mongolia,China [J].PlantProtection,2009,35(5):114-117.

[15]彭德良,黃文坤,孫建華,等.我國天津發(fā)現(xiàn)小麥禾谷孢囊線蟲 [M]//中國線蟲學研究(第四卷).北京：中國農業(yè)科學技術出版社,2012:162-163.

Peng D L,Huang W K,Sun J H,etal.First Report of Cereal Cyst Nematode(Heteroderaavenae)in Tianjin,China [M]//Nematology Research in China(Vol.4).Beijing:China Agriculture Scientech Press,2012:162-163.

[16]候生英,彭德良,王愛玲,等.青海省小麥孢囊線蟲病調查初報 [J].青海大學學報:自然科學版,2008,26(5):84-86.

Hou S Y,Pen D L,Wang A L,etal.Preliminary report of investigation on cereal cyst nematode of wheat in Qinghai Province [J].JournalofQinghaiUniversity:NatureScience,2008,26(5):84-86.

[17]楊傳廣,吳慧平,檀根甲,等.安徽省小麥孢囊線蟲田間分布及危害調查 [J].植物保護,2008,34(2):107-110.

Yang C G,Wu H P,Tan G J,etal.Investigations on the distribution of and damages caused by cereal cyst nematode in Anhui [J].PlantProtection,2008,34(2):107-110.

[18]李惠霞,柳永娥,魏 莊,等.新疆和西藏發(fā)現(xiàn)禾谷孢囊線蟲 [M]//中國線蟲學研究(第四卷).北京：中國農業(yè)科學技術出版社,2012:164-165.

Li H X,Liu Y E,Wei Z,etal.The Detection ofHeteroderaavenaefrom the Cereal Field in Autonomous Regions of Tibet and Xinjiang [M]//Nematology Research in China(Vol.4).Beijing:China Agriculture Scientech Press,2012:164-165.

[19]Peng D,Ye W,Peng H,etal.First report of the cyst nematode(Heteroderafilipjevi) on wheat in Henan province,China [J].PlantDisease,2010,94(10):1262.

[20]Li H,Yuan H,Sun J,etal.First record of the cereal cyst nematodeHeteroderafilipjeviin China [J].PlantDisease,2010,94(12):1505.

[21]郝 瑞,黃文坤,劉崇俊,等.新型種衣劑防治小麥禾谷孢囊線蟲病研究 [J].植物保護,2014,40(1):182-186.

Hao R,Huang W K,Liu C J,etal.Effect of seed-coatings on controlling cereal cyst nematode(Heteroderaavenae) of wheat [J].PlantProtection,2014,40(1):182-186.

[22]Singh A,Sharma A,Shoran J,etal.Heteroderaavenaeand its management on wheat in India [C]//Proceedings of the First Workshop of the International Cereal Cyst Nematode Initiative,Antalya,Turkey,2009:21-23.

[23]張樹武,徐秉良,薛應鈺,等.長枝木霉對小麥禾谷孢囊線蟲的致死作用 [J].應用生態(tài)學報,2014,25(7):2093-2098.

Zhang S W,Xu B L,Xie H Y,etal.Lethal effects ofTrichodermalongibrachiatumonHeteroderaavenae[J].ChineseJournalofAppliedEcology,2014,25(7):2093-2098.

[24]Williams J G K,Kubelik A R,Livak K J,etal.DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic marker [J].NucleicAcidsResearch,1990,8:6531-6535.

[25]Welsh J,Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J].NucleicAcidsResearch，1990,18:7213-7218.

[26]Hashmi G,Glazer I,Gaugler R I.Molecular comparisons of entomopathoganic nematodes using randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) makers [J].FundamentalandAppliedNematology,1996,19(4):399-406.

[27]Caswell-Chen E P,Williamson V M,Wu F F,etal.Random amplified polymorphic DNA analysis ofHeteroderacruciferaeandH.schachtiipopulations [J].JournalofNematology,1992,24(3):343-351.

[28]Lopez-Braiia I,Romero M D,Delibes A.Analysis ofHeteroderaavenaepopulations by the random amplified polymorphic DNA technique [J].Genome,1996,39(1):118-122.

[29]鄭經武,許建平,陳衛(wèi)良,等.四種植物線蟲的RAPD比較及鑒定研究 [J].農業(yè)生物技術學報,1998,6(2):108-116.

Zheng J W,Xu J P,Chen W L,etal.Molecular comparison and identification of four plant nematodes using randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) markers [J].JournalofAdriculturalBiotechnology,1998,6(2):108-116.

[30]劉 佳,徐 嬌,代君麗,等.中國黃淮麥區(qū)燕麥孢囊線蟲滎陽群體致病型相關RAPD標記的建立 [J].麥類作物學報,2013,33(6):1294-1299.

Liu J,Xu J,Dai J L,etal.RAPD markers ofHeteroderaavenaeXingyang population from Huang-huai Floodplain in China [J].JournalofTriticeaeCrops,2013,33(6):1294-1299.

[31]Meng Q P,Long H,Xu J H.PCR assays for rapid and sensitive identification of three major root-knot nematodes,Meloidogyneincognita,M.javanicaandM.arenaria[J].ActaPhytopathologicaSinica,2004,34(3):204-210.

[32]Ou S Q,Peng D L,Liu X M,etal.Identification ofHeteroderaglycinesusing PCR with sequence characterised amplified region(SCAR) primers [J].Nematology,2008,10(3):397-403.

[33]Adam M A M,Phillips M S,Blok V C.Molecular diagnostic key for identification of single juveniles of seven common and economically important species of root-knot nematode(Meloidogynespp.) [J].PlantPathology,2007,56:190-197.

[34]亓曉莉,彭德良,彭 煥,等.基于SCAR 標記的小麥禾谷孢囊線蟲快速分子檢測技術 [J].中國農業(yè)科學,2012,45(21):4388-4395.

Qi X L,Peng D L,Peng H,etal.Rapid molecular diagnosis based on SCAR marker system for cereal cyst nematode [J].ScientiaAgriculturaSinica,2012,45(21):4388-4395.

[35]楊衛(wèi)星.河南省小麥禾谷孢囊線蟲致病型及發(fā)生規(guī)律研究 [D].洛陽:河南農業(yè)大學,2008.

Yang W X.Pathotype and occurrence of cereal cyst nematode(Heteroderaavenae) [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2008.

[36]孫君偉.黃淮麥區(qū)四個禾谷孢囊線蟲群體種類和致病型鑒定及主推品種的抗性評價 [D].洛陽:河南農業(yè)大學,2010.

Sun J W.Identification of species and pathotypes from four cereal cyst nematode populitions in Huanghuai wheat plant area and evaluation of main wheat cultivars resistance to two populations [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2010.

[37]侯興松.豫西豫北及豫南地區(qū)4個禾谷孢囊線蟲群體種類和致病型鑒定及品種抗性研究 [D].洛陽:河南農業(yè)大學,2011.

Hou X S.Identification on the species and pathotypes of four cereal cyst nematode populationa from western and northern Henan,southern Hebei and evaluation of wheat cultivars resistance to two populations [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2011.

[38]年高磊.魯豫皖交界地區(qū)四個CCN群體種類和致病型鑒定及品種對淮陽群體的抗性評價 [D].洛陽:河南農業(yè)大學,2011.

Nian G L.Identification of species and pathotypes of four cereal cyst nematode populations from Shandong,Henan and Anhui contiguous areas and resistance evaluation of wheat cultivars to Huaiyang populations [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2011.

[39]張 鵬.河南中部地區(qū)三個CCN群體種類和致病型鑒定及抗性品種篩選 [D].洛陽:河南農業(yè)大學,2012.

Zhang P.Identification on the species and pathotypes of three cereal cyst nematode populations from the middle area of Henan province and screening of resistant cultivars to two populations [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2012.

[40]李洪連.小麥禾谷孢囊線蟲病 [M]//植物線蟲學.北京：科學出版社,2011:155-162.

Li H L.Wheat Cyst Nematode Disease [M]//Plant Nematology.Beijing:Science Press,2011:155-162.

[41]Peng D,Nicol J M,Li H,etal.Current knowledge of cereal cyst nematode(Heteroderaavenae) on wheat in China [C]//Cereal Cyst Nematode:Status,Research and Outlook.Ankara,Turkey,2009:29-34.

[42]Bekal S,Gauthier J P,Rivoal R.Genetic diversity among a complex of cereal cyst nematode inferred from RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacer region [J].Genome,1997,40:479-486.

[43]Abidou H,Valette S,Gauthier J P,etal.Molecular polymorphism and morphometrics of species of theHeteroderaavenaegroup in Syria and Turkey [J].JournalofNematology,2005,37(2):146-154.

[44]Yan G P,Smiley R W.DistinguishingHeteroderafilipjeviandH.avenaeusing polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism and cyst morphology [J].Phytopathology,2009,100:216-224.

[45]彭德良,葉文興,顧曉川,等.我國首次發(fā)現(xiàn)菲利普孢囊線蟲(Heteroderafilipjevi)危害小麥 [M]//中國線蟲學研究.北京：中國農業(yè)科學技術出版社,2013:162-163.

Peng D L,Ye W X,Gu X C,etal.First Report ofHeteroderafilipjevion Wheat in China [M]//Nematology Research in China.Beijing:China Agriculture Scientech Press,2010:162-163.

[46]Yan G P,Smiley R W,Okubara P A,etal.Species-specific PCR assays for differentiatingHeteroderafilipjeviandH.avenae[J].PlantDisease,2013,97(12):1611-1619.

[47]Peng H,Qi X L,Peng D L,etal.Sensitive and direct detection ofHeteroderafilipjeviin soil and wheat roots by species-specific SCAR-PCR assays [J].PlantDisease,2013,97(10):1288-1294.

[48]Toumi F,Waeyenberge L,Viaene N,etal.Development of two species-specific primer sets to detect the cereal cyst nematodesHeteroderaavenaeandHeteroderafilipjevi[J].EuropeanJournalofPlantPathologyl,2013,136:613-624.

Development of SCAR Marker for DetectingHeteroderafilipjeviof Huaiyang and Boai Pathotype Populations from Wheat-growing Regions of the Huang-Huai-Hai Plain in China

XU Jiao,LIU Jia,DAI Junli,LI Honglian

(College of Plant Protection,Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops,Zhengzhou,Henan 450002,China)

Abstract:Heterodera filipjevi was discovered in the Huang-Huai-Hai Plain in China and is a new pathogenic nematode of wheat. It seriously threatens wheat production due to the capability of high pathogenicity. Identification of pathogenic pathotype is quite important for screening and breeding of disease-resistant wheat cultivars.In order to establish a kind of rapid,convenient,and accurate method based on SCAR markers,random amplified polymorphism DNA(RAPD) techniques was used to analyze five pathotypes,including nine cereal cyst nematode(CCN) populations. A total of 97 random primers were screened and 2 of them,S232 and S278,produced distinct bands that were specific for Huaiyang and Boai populations of H.filipjevi based on RAPD method. The two specific bands were 550 base pair(bp),and 1 700 bp in size,respectively. Subsequently,a SCAR marker SC-S232 was developed according to the RAPD marker S232. The results showed that SC-S232 marker amplifies a positive band with a size of 517 bp from the Huangyang and Boai pathotype populations of H.filipjevi,but none product from other pathotype populations of CCN in the Huang-Huai-Hai plain. This SCAR marker SC-S232 can be used to detect the Huangyang and Boai pathotype populations in this region.

Key words:Wheat; Heterodera filipjevi; Pathotype; Molecular detection

中圖分類號：S512.1；S435

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)04-0523-08

通訊作者：代君麗(E-mail: daijl666@sina.com); 李洪連(E-mail: honglianli@sina.com)

基金項目：國家自然科學基金項目(31101419)；國家公益性(農業(yè))科研專項(200903040-4)

收稿日期：2015-11-08修回日期：2015-12-24

網絡出版時間：2016-04-01

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160401.1534.038.html

第一作者E-mail：1789985160@qq.com