小麥品種濰麥8號2AS染色體上的抗葉銹病QTL定位

朱 琳，王佳真，師令智，任志寬，李 星，劉大群

(河北省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心,河北農業大學植物保護學院,河北保定 071001)

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小麥品種濰麥8號2AS染色體上的抗葉銹病QTL定位

朱 琳，王佳真，師令智，任志寬，李 星，劉大群

(河北省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心,河北農業大學植物保護學院,河北保定 071001)

摘要：為了解小麥品種濰麥8號抗葉銹基因在染色體上的位置，利用EST標記對濰麥8號2AS染色體上的抗葉銹病QTL進行檢測和分子作圖。2011-2013年，對抗病品種濰麥8號×感病品種鄭州5389雜交得到的179個F2:3家系及其親本進行成株期抗葉銹病鑒定，得到表型數據。前期研究已利用SSR標記在濰麥8號2AS染色體上檢測到一個主效QTL，為了尋找與該QTL距離更近的標記，本試驗通過35個位于2AS染色體上的EST標記檢測親本及其F2:3家系，結果表明，4個EST標記與抗葉銹病QTL連鎖，該QTL位點被定位在BE444541和CD452782之間，區間距離為11.3 cM，3年解釋的遺傳變異分別為63.59%、62.48%和62.43%。

關鍵詞：小麥；葉銹病；EST標記；QTL作圖

小麥葉銹病是由葉銹菌(Puccinia triticina)侵染引起的真菌性病害，對我國小麥生產具有嚴重危害。該病害直接為害小麥葉片，通過影響其光合作用，導致小麥產量和品質下降，造成嚴重的經濟損失。應用抗病品種和提高小麥品種的抗病性是防治小麥葉銹病最重要的途徑。

表達序列標簽(Expression sequenee tag，EST)，是將mRNA轉錄為cDNA并克隆到載體構建cDNA文庫，然后大規模隨機挑選cDNA克隆，對其5′或3′端進行一步法測序，通過將所獲序列與已知基因庫序列進行比較，獲得對生物體生長發育、繁殖分化、遺傳變異和衰老死亡等生命過程認識的技術[1]。由于EST序列是基因的一部分，因此其多態性與功能直接相關。其次，EST標記資源豐富，成本低廉，可用于進行大量目的基因的篩選，特別適合數量性狀位點的比較[2]。

小麥數量性狀位點(Quantitative trait loci，QTL)控制數量性狀基因，一般在小麥成株期對葉銹病表現非小種專化抗性，因此又叫成株抗性(adult-plant resistance，APR)或慢病性。慢病性受多基因控制[3-5]，表現為數量性狀和持久抗病性。已經發現的慢葉銹性基因有 Lr34[6]、 Lr46[7]、 Lr67[8]、 Lr68[9]，在田間均表現出良好的抗性。但目前發現的小麥抗葉銹QTL僅有80多個，主要集中在1BS、1BL、2BS、6BS、7BL上[10]，所以有必要開發更多更有效的QTL及其相關分子標記。

濰麥8號是由山東濰坊市農科院作物所以88-3149為母本、以Aus621108為父本經過有性雜交選育成的小麥新品種。該品種綜合農藝性狀良好，同時高抗白粉病和葉銹病，是一個良好的小麥抗葉銹性資源[11]。本實驗室前期研究中利用SSR引物對淮麥8號抗葉銹QTL進行了定位，發現在2AS染色體上存在一個主效QTL[12]。為了篩選與該位點距離更近的標記，本研究通過EST標記對濰麥8號品種2AS染色體上的抗葉銹QTL進行分子作圖，以期為利用濰麥8號培育抗葉銹病小麥新品種提供理論依據。

1材料與方法

1.1小麥材料和葉銹菌菌種

供試小麥材料為抗病親本濰麥8號和感病親本鄭州5389及其雜交獲得的179個F2:3家系。供試葉銹菌生理小種為THTT、THTS和THTQ，用于小麥成株期田間的接種鑒定。以上材料均由河北農業大學植物免疫研究室提供。

1.2小麥成株期葉銹病田間嚴重度調查

2010-2012年連續3年11月初在河北農業大學實驗田采用條播法種植，行長1.5 m，每行種50粒，行距25 cm。每10行種植1行對照(感病品種鄭州5389)，在與試驗材料垂直的方向種植誘發行(感病品種鄭州5389)。在每年的小麥分蘗階段(保定地區每年在四月中旬)將等量葉銹菌生理小種THTT、THTS和THTQ混合，配置成0.05%吐溫20孢子懸浮液，噴施于誘發行。接種后用塑料薄膜覆蓋，隔夜保濕15 h左右后去除薄膜。在進行田間鑒定前要注意澆水，保證田間微氣候濕潤，為發病創造適宜條件。待鄭州5389發病嚴重度達到50%以上時(即葉銹菌面積占葉片面積比例50%以上)，進行田間第一次鑒定，之后每周鑒定一次，直到鄭州5389發病嚴重度達到100%、群體發病嚴重度達到最大，此時所達到的嚴重度稱為最終嚴重度(Final disease severity，FDS)，用作最終QTL分析的表型數據。

1.3抗感小群體的建立

選取最終嚴重度最低及最高的家系各5個，分別作為抗病和感病小群體，用于后續篩選EST標記。

1.4小麥DNA的提取及PCR擴增

參照Sharp等[13]的CTAB法提取小麥幼嫩葉片的DNA，略作改進。10 μL PCR反應體系中分別加入模板DNA (30 ng·μL-1) 1 μL，10× PCR buffer (含MgCl2) 1 μL，dNTP (10 mmol·L-1) 0.2 μL，引物(4 μmol·L-1)1 μL，10 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.1 μL，超純水6.7 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性45 s，55 ℃(根據不同引物略有變化)退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進行35個循環，最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存PCR產物。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對其進行檢測。電泳后的凝膠參照Bassam等[14]的方法銀染檢測，記錄結果。

1.5EST分子標記的篩選

本實驗室前期研究已利用SSR標記在濰麥8號2AS染色體檢測到一個主效QTL[12]，為了尋找與此QTL距離更近的分子標記，因此用分布在2AS染色體上的35對EST引物進一步篩選親本和抗感小群體是否存在多態性，并利用多態性引物對群體進行篩選。EST引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.6QTL連鎖圖譜構建

用篩選出來的分子標記檢測179個F2:3家系，PCR擴增帶型結合表型數據進行連鎖分析，通過Map Manager QTXb20軟件構建遺傳連鎖圖譜。用QTL Icimapping 3.2做QTL檢測，LOD閾值設為2.5。

2結果與分析

2.1濰麥8號田間抗病性鑒定結果

2011-2013連續3年在田間對濰麥8號和鄭州5389及其F2:3代家系抗葉銹病表型數據進行鑒定，得出3年的最終嚴重度分布數據(圖1)。在感病親本鄭州5389發病嚴重度達到100%時，濰麥8號連續3年的最終嚴重度均為10%。F2:3代家系的最終嚴重度呈連續分布，符合數量性狀遺傳特點，說明濰麥8號中可能存在若干控制小麥抗葉銹病的QTL位點。由于小麥成株抗性與環境相關，田間調查數據顯示，在2011年和2013年，各家系最終嚴重度的分布趨勢相近，而與2012年各家系最終嚴重度的分布趨勢不同；比較各年份間田間表型數據可知，2012年整體發病較嚴重。

圖1　濰麥8號×鄭州5389及其179個F2:3家系葉銹病三年最終嚴重度的分布

2.2標記篩選結果

用小麥2AS染色體上的35對EST引物對抗感親本和抗感小群體進行篩選，其中有4對引物可以擴增出多態性片段，可以推斷這4對引物可能與位于2AS染色體上的數量性狀位點相關聯。4對EST引物分別為：BE444659_cp (上游5′-TAA GGAGGCAATTGACAGGG-3′,下游5′-GCA AACTCCACAGCCTCTTC-3′)、BE444541_cp(上游5′-CTTAGGAGTACCCCTTGGGC-3′,下游5′-GCAAATGAAGAAGCGTGTGA-3′)、CD452782_cp (上游5′-TCACACCTTCCCCAAGTTTC-3′,下游5′-TCACACGCTTCTTCATTTGC-3′)、BE405597_cp (上游5′-GTGTTTTCACTGGC AAGCAA-3′,下游5′-GCCTATTAGTCGCAGC AAGG-3′)。它們均在抗病親本與感病親本中擴增出特異性帶(圖2)。用這4對引物繼續對179個F2:3代家系進行篩選，發現引物BE405597_cp在群體中多態性不穩定，個別家系出現帶型與表型不吻合的現象，其余三對引物在群體中多態性表現較穩定。

M：DL 2000 Marker；P1：抗病親本濰麥8號；P2：感病親本鄭州5389；R:抗病單株；S：感病單株；箭頭指示特異性條帶

M: DL 2000 Marker; P1: Resistant parent Weimai 8; P2: Susceptible parent Zhengzhou 5389; R: Resistant individual; S: Susceptible individual;Arrows indicate specific bands

圖2引物BE444659_cp在抗感小群體中的PCR擴增

Fig.2PCR amplification with primer BE444659_cp

in resistant and susceptible plants

2.3QTL連鎖圖譜

根據濰麥8號和鄭州5389雜交所得的179個F2:3家系連續三年的田間鑒定表型數據進行EST標記篩選，利用分析軟件Map Manager QTXb20和QTL Icimapping 3.2進行結果分析，最終在小麥2AS染色體上檢測到1個控制成株抗葉銹的QTL位點，發現3個分子標記與濰麥8號抗葉銹QTL連鎖，分別為BE444659、BE444541和CD452782(圖3)。三個標記的區間距離為11.3 cM，該位點在連續三年的田間鑒定中解釋的遺傳變異分別為63.59%、62.48%和62.43%(表1)。距離該QTL最近的兩個位點為CD452782和BE444659，距離為7.1 cM。

圖3　2AS染色體上控制小麥成株抗葉銹QTL的位置

年份Year染色體Chromosome左標記Lefemarker右標記RightmarkerLOD值LODscore加性效應Additive顯性效應Dominate貢獻率Var./%20112ASCD452782BE44465925.2934.010.0063.5920122ASCD452782BE44465928.9835.660.0062.4820132ASCD452782BE44465927.0434.830.0062.43

3討 論

本研究通過EST標記對小麥品種濰麥8號2AS染色體上一個QTL進行了定位，但在結果中發現個別EST引物在F2:3代家系中多態性不穩定。為了提高EST標記的多態性，可以對無多態擴增產物進行酶切，以揭示剪切擴增多態性(Cleavage Amplified Polymorphism，CAP)；或改進對PCR產物的分析手段，如采用分辨率較高的變性梯度膠分離PCR產物，提高多態檢測率[15]。

通過Map Manager QTXb20軟件構建遺傳連鎖圖譜，用QTL Icimapping 3.2進行結果分析，QTL被定位在BE444659和CD452782之間,區間距離為7.1 cM，三年解釋的遺傳變異分別為63.59%、62.48%和62.43%，從而證實此QTL位點可信度較高，并且效應較大。

成株抗病性由多個數量性狀位點控制，相對于小種專化抗性具有抗病持久的優點，此外由于成株抗病性QTL具有一因多效的特點，加強對慢病性基因的合理利用有利于同時防治小麥白粉、條銹等多種病害[16]。本實驗在2AS染色體上檢測出一個QTL，且具有較大效應，對存在于其他染色體上的QTL還需要通過SSR、EST等進行進一步檢測。目前，位于2AS染色體上已知的小麥抗葉銹基因有 Lr37[17]，該基因來源于偏凸山羊草(Aegilopsventricosa)2N染色體，表現出優異的成株抗性。 Lr37基因與抗條銹基因 Yr17和抗桿銹基因 Sr38緊密連鎖， Lr37-Yr17-Sr38連鎖群被Helguera等[18]運用RFLP標記 cmwg682定位在2AS上10 cM左右。根據2004年Somers等[19]繪制的得到國際公認的面包小麥高密度SSR標記圖譜可知，本實驗在淮麥8號中發現的QTL位點被定位在2A染色體短臂末端，與 Lr37存在一定距離。 Lr37與本實驗標記的QTL之間的關系還需要進一步通過高通量SNP分子標記進行驗證。

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QTL Mapping of Leaf Rust Resistance in 2AS Chromosomal of the Wheat Cultivar Weimai 8

ZHU Lin,WANG Jiazhen,SHI Lingzhi,REN Zhikuan,LI Xing,LIU Daqun

(Biological Control Center of Plant Diseases and Pests of Hebei Province,College of Plant Protection,Agricultural University of Hebei,Baoding，Hebei 071001,China)

Abstract:To understand the chromosomal position of leaf rust resistance genes in Chinese wheat cultivar Weimai 8,molecular mapping of the leaf rust resistance loci was conducted using EST markers in this study. In 2011-2013,179 F2:3lines derived from the cross of Weimai 8 × Zhengzhou 5389 and the parents to obtain the phenotypic data on their reactions to leaf rust at the adult plant stage. A major effective QTL on chromosome 2AS of Weimai 8 has been found using SSR markers.In order to find closer markers of the QTL,thirty-five EST markers located on chromosome 2AS were screened between the parents and F2:3lines. The results indicated that four EST markers linked to the QTL for leaf rust resistance were identified,which was located between markers BE444541 and CD452782,with an interval distance of 11.3 cM. This QTL explained 63.59%,62.48% and 62.43% of the phenotypic variations in the three years tests,respectively.

Key words:Wheat; Leaf rust; EST marker; QTL mapping

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)02-0145-05

通訊作者：李 星(E-mail: lixing@hebau.edu.cn)；劉大群(E-mail: ldq@hebau.edu.cn)

基金項目：國家自然科學基金國際(地區)合作與交流項目(31361140367)；高等學校博士學科點專項科研基金聯合資助課題(20131302120004)；植物病蟲害生物學國家重點實驗室開放基金資助課題(SKLOF201513)；河北省引進留學人員資助項目(C2015003033)

收稿日期：2015-09-14修回日期：2015-11-25

網絡出版時間：2016-01-26

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160126.1944.006.html

第一作者E-mail: ezzhulin@sina.com(朱 琳)；858189486@qq.com(王佳真,并列第一作者)