節節麥幼胚再生體系的建立

徐 鳳，李春蓮，李 揚，柴乖強，王中華

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

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節節麥幼胚再生體系的建立

徐 鳳，李春蓮，李 揚，柴乖強，王中華

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

摘要：為建立高效的節節麥幼胚再生體系，以節節麥幼胚為外植體，通過正交設計，探索基本培養基、2,4-D、碳源、KT等因素對幼胚愈傷組織誘導、分化及植株再生效果的影響。結果表明，4 種因素中，基本培養基對節節麥幼胚愈傷組織誘導的影響最顯著(P<0.05)，2,4-D濃度對節節麥幼胚愈傷組織誘導也有顯著影響(P<0.05)，添加3.0 mg·L-12,4-D的培養基誘導出的愈傷組織質量高，淡黃色，表面呈不規則顆粒狀，質地致密，再生頻率可以達到17.62%。KT濃度對節節麥愈傷分化影響最顯著，基本培養基、2,4-D和碳源對節節麥幼胚愈傷分化均無顯著影響。不同碳源對節節麥幼胚愈傷組織誘導和分化的影響均不顯著，為節約成本可直接選用30 g·L-1蔗糖作為碳源。節節麥幼胚組織培養的最佳組合是：愈傷誘導培養基為MS培養基+3 mg·L-12,4-D+ 15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇，愈傷分化培養基為MS培養基+15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇+1.0 mg·L-1KT。

關鍵詞：節節麥；幼胚；胚性愈傷；愈傷分化

采用現代基因工程方法將優良基因導入小麥對其進行遺傳改良是當前小麥育種的一個新方向。目前小麥基因工程育種進展緩慢，這一方面是由于普通小麥基因組序列龐大，它含有A、B、D三個同源染色體組，基因組約包含170億個堿基，這一數值是玉米的7倍和水稻的35倍，約有124 000個基因[1]，而且基因之間存在冗余、干擾等現象，使其功能基因的研究十分困難；另一方面由于小麥的遺傳轉化效率很低，使得基因工程育種無法得到廣泛應用。節節麥(Aegilopstauschii)作為小麥D基因組的供體，其基因組小、遺傳背景簡單。節節麥的D基因組對小麥基因組的研究具有重要的參考價值，它的序列已經廣泛應用到小麥基因序列分析中，因而節節麥成為小麥育種的重要資源[2]。節節麥具有較高的遺傳多樣性和較強的抵抗各種生物和非生物脅迫的能力，這些性狀都有助于小麥品種的改良[3-4]。此外，D基因組提供了許多與小麥品質相關的基因，節節麥可以為小麥品質改良及小麥D基因組功能研究提供參考。

要研究節節麥的基因功能，首先要建立一個高效而穩定的遺傳轉化體系，而遺傳轉化效率的高低主要取決于組織培養中植株再生頻率的高低。目前，小麥組織培養技術已十分成熟，在研究過程中積累了豐富的經驗，這為節節麥組織培養體系的建立提供了重要參考。前人研究表明，影響小麥組織培養的主要因素有基因型、外植體、外源激素、培養基類型等[5-10]。另外，還有研究者通過調整碳源的種類和比例來改善愈傷組織的質量[11]。但到目前為止，關于節節麥幼胚再生體系的研究尚未見報道。基于前人關于小麥組織培養的研究成果，筆者選擇節節麥幼胚為外植體，通過4因素16水平的正交設計試驗，探索基本培養基、2,4-D、碳源、KT等因素對節節麥幼胚愈傷組織誘導、分化及植株再生的影響，旨在篩選適合節節麥幼胚組織培養的體系，為節節麥遺傳轉化研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用節節麥的種子由西北農林科技大學標本區提供。

1.2試驗方法

1.2.1正交試驗設計

采用SPSS 18.0軟件進行4因素不同水平正交試驗設計，各因素水平如下：基本培養基分為3個水平，分別為MS培養基(Ⅰ)、N6培養基(Ⅱ)、B5培養基(Ⅲ)；2,4-D濃度分為4個水平，分別為1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1；碳源分為4個水平，分別為30 g·L-1蔗糖(A)、30 g·L-1麥芽糖(B)、15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇(C)、15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1山梨醇(D)；KT濃度分為3個水平，分別為1.0、1.5、2.0 mg·L-1，實驗設計如表1所示，共16個組合。

表1　4因素不同水平的正交設計

以上培養基pH值均為5.8，121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

1.2.2幼胚的選擇及消毒

節節麥抽穗揚花時進行掛牌標記，揚花后10～12 d取標記穗子帶回實驗室，插入水中以免失水幼胚活性降低，置于4 ℃冰箱中低溫處理1～2 d，然后用鑷子剝出籽粒，75%酒精表面消毒約 1 min，無菌水沖洗2～3遍，15%NaClO消毒20 min，無菌水沖洗3～5遍。

1.2.3愈傷組織誘導及分化

消毒后的節節麥未成熟種子用鑷子固定，用手術刀挑出幼胚(大小約為0.5～1.5 mm)，盾片朝上接種在相應的愈傷組織誘導培養基上，每一皿培養基上接種大約80枚幼胚，每個處理重復3次，25 ± 1 ℃黑暗條件下培養,每兩周更換一次培養基。將誘導30 d的愈傷組織轉至相應的分化培養基上進行分化培養，此時應轉入光照培養箱中培養，光強為2 500～3 000 lx，每天光照16 h，溫度為25 ± 1 ℃，每兩周更換一次培養基。

1.2.4生根和壯苗

將愈傷組織表面出現綠點、綠色芽苗及葉狀結構的愈傷塊轉接于新鮮的分化培養基上進行芽苗誘導。待芽苗長至3～5 cm高時將這些芽苗或分蘗基部的愈傷塊切除，再將芽苗轉至生根培養基上進行生根培養。

1.2.5組培苗的移栽

準備好育苗基質，用水浸透。挑選根的長度為3～5 cm的組培苗進行移栽，移栽過程中盡可能清除多余的培養基。在移栽后的花缽上覆蓋一層保鮮袋，防止植株失水，同時將移栽苗放在弱光條件下2 d，再除去保鮮袋，轉在正常光照下培養。

1.3愈傷組織的觀察和記錄

幼胚接種到愈傷組織誘導培養基15 d后，觀察愈傷組織出愈質量，并記錄質量等級。“+”表示愈傷組織質量差，水浸狀，質軟，蒼白色或者褐變，甚至死亡，或者愈傷塊長有大量毛狀根；“+ +”表示愈傷組織質量中等，淡黃色，比較干燥，有顆粒狀胚性愈傷出現； “+++ ”表示愈傷組織質量高，黃色或淡黃色，表面呈不規則顆粒狀，質地致密。

1.4數據統計

接種幼胚后7d統計誘導出的愈傷數，計算出愈率；轉移至分化培養基之前,統計胚性愈傷數，計算胚性愈傷率；分化培養40 d后，統計愈傷組織分化率；分化出的綠芽轉至生根培養基，計算成苗率。所有數據通過SPSS 18.0軟件方進行差分析，顯著性水平為P=0.05。

出愈率= 形成愈傷組織的幼胚數/接種幼胚數×100%；

胚性愈傷率= 形成胚性愈傷組織的幼胚數/ 接種幼胚數×100%；

愈傷分化率= 分化出綠芽原基或綠芽的愈傷組織塊數/接種的愈傷組織數×100%；

成苗率=成苗數/接種愈傷組織數×100%。

2結果與分析

2.1不同處理對節節麥幼胚的誘導、分化及再生的影響

從圖1和表2 可以看出，第3、8、9、16處理下節節麥的愈傷組織質量最高，第2、7、11、12、15處理的愈傷組織質量較差；出愈率較高的處理有3、5、15、16(分別為94.76%、93.62%、93.30%、94.38%)，出愈率較低的處理有2、7、12、13(分別為83.41%、84.68%、85.77%、85.50%)；胚性愈傷率較高的處理有3、8、9、16(分別為85.02%、78.10%、80.22%、82.40%)，胚性愈傷率較低的處理有2、7、11、12(分別為50.22%、46.77%、44.84%、55.65%)；愈傷分化率較高的處理有3、5、9、10(分別為59.29%、34.47%、63.12%、38.66%)，愈傷分化率較低的處理有6、11、12、16(愈傷分化率分別為2.94%、3.59%、2.92%、3.97%)；成苗率較高的處理有3、8、9、10(分別為16.21%、6.35%、17.62%、10.92%)，成苗率較低的處理有6、12、13、16(分別為0、0、1.34%、0)。節節麥再生體系的建立最重要的是要得到組培再生苗，本實驗16個處理中處理9的成苗率最高，因此這16個組合中處理9為最佳組合。

2.2試驗因素重要性比較

綜合分析影響節節麥幼胚愈傷組織誘導的各個因素，從表3可以看出，各因素的重要性依次為基本培養基> 2,4-D > 碳源，根據各因素的最佳水平，初步可以推斷節節麥幼胚胚性愈傷率最高的組合為：MS培養基，2,4-D濃度為2 mg·L-1，碳源為麥芽糖。對試驗各個因素進行方差分析，表3結果顯示，基本培養基和2，4-D各水平間胚性愈傷率差異達顯著水平(P<0.05)，而碳源各水平間的胚性愈傷率差異不顯著(P>0.05)。說明基本培養基和2,4-D對節節麥幼胚胚性愈傷組織誘導有很大影響，而碳源的作用并不明顯。

A、B、C分別為處理9、10、11誘導30 d的愈傷組織，D、E、F分別為處理9、10、11分化培養45 d的分化情況

The fig.A,B,C are the callus of treatment 9,10,11 induced for 30 days,respectively;The fig.D,E,F are the callus of treatment 9,10,11 induced for 45 days,respectively

圖1節節麥幼胚部分處理的胚性愈傷及愈傷分化

Fig.1Images of embryonic callus and callus differentiation ofAegilopstauschiiimmature embryo for part of treatment

綜合分析影響節節麥幼胚愈傷組織分化的各個因素，從表4可以看出，各因素的重要性依次為 KT>2,4-D>基本培養基>碳源。根據各因素的最佳水平，初步可以推斷節節麥幼胚愈傷分化率最高的組合為：KT濃度為1.0 mg·L-1，2,4-D濃度為3 mg·L-1，MS培養基，碳源是15 mg·L-1蔗糖+15 mg·L-1甘露醇。對各個因素進行方差分析，結果顯示KT各水平間愈傷分化率差異達顯著水平(P<0.05),而2，4-D濃度、基本培養基和碳源的各水平間的愈傷分化率差異不顯著(表4)。表明KT濃度對節節麥幼胚愈傷的分化有很大影響，而2，4-D濃度、基本培養基和碳源的作用不明顯。為尋找各因素相應的最佳水平，還需進一步對試驗各因素的不同水平進行多重比較。

表2　不同處理對節節麥幼胚誘導、分化及再生的影響

“+”表示愈傷組織質量差；“+ +”表示愈傷組織質量中等；“+++ ”表示愈傷組織質量高

“+” shows poor quality of callus; “+ +” shows medium quality of callus; “+++” shows high quality of callus

2.3各試驗因素對節節麥幼胚胚性愈傷率的影響

2.3.1基本培養基對胚性愈傷率的影響

表3結果表明，在本試驗的3個因素中，基本培養基對胚性愈傷率影響最顯著。3種培養基中，胚性愈傷率最高的是MS培養基，為74.41%；其次為N6培養基，為63.11%；最后是B5培養基，為54.41%。MS培養基與N6培養基對應的胚性愈傷率之間差異不顯著，但與B5培養基對應的胚性愈傷率之間差異顯著。就愈傷組織質量而言，MS培養基的愈傷組織質量最高，B5培養基培養基的愈傷組織易長出毛狀根，質量最差。上述結果表明，在節節麥胚性愈傷組織誘導中MS培養基明顯優于B5培養基，MS和N6兩種基本培養基均可選用。

2.3.22,4-D濃度對胚性愈傷率的影響

從表3中可以看出，胚性愈傷率隨2,4-D濃度的升高呈先升高后下降的趨勢，當濃度達到2 mg·L-1時，胚性愈傷率達到最高(75.26%)，而后明顯下降。2,4-D濃度為2 mg·L-1時，所對應的胚性愈傷率顯著高于濃度為1 mg·L-1和 4 mg·L-1的，但與濃度為3 mg·L-1時所對應的胚性愈傷率(74.81%)差異不顯著。2,4-D濃度為1 mg·L-1時，愈傷組織易向分化方向發展，易長出毛狀根和實生芽，導致愈傷組織質量下降，而當2,4-D濃度達到4 mg·L-1時，又會抑制胚性愈傷組織的形成，并導致所形成的愈傷組織生長較慢。據此推斷，節節麥幼胚誘導愈傷組織2,4-D的最佳濃度為2 mg·L-1。

2.3.3碳源對胚性愈傷率的影響

由表3可知，碳源各水平所對應的胚性愈傷率之間的差異未達到顯著水平。碳源各水平中，胚性愈傷率最高的是30 g·L-1麥芽糖(67.43%)，最低的是15 mg·L-1蔗糖+15 mg·L-1山梨醇(65.73%)。由于四種碳源對節節麥胚性愈傷的誘導差異不顯著，因此四種碳源均可選用。在實際操作中，為節省成本，可以直接選用蔗糖作為碳源。

表3　不同因素水平下的胚性愈傷率及水平間的差異顯著性

同行數據后不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著，不同大寫字母表示0.01水平上差異顯著。表4同

Different lower-case letters in the same line mean differences significant at 0.05 levels,and different upper-case letters mean difference significant at 0.01 levels,respectively.The same as in the table 4

2.4各試驗因素對節節麥幼胚愈傷分化率的影響

2.4.1KT濃度對愈傷分化率的影響

表4結果表明，本研究的4個因素中，KT濃度對節節麥愈傷分化率影響最顯著。愈傷分化率隨KT濃度增加而減小，KT濃度為1 mg·L-1時愈傷分化率最高(33.71%)，當濃度增加為1.5 mg·L-1和2 mg·L-1時愈傷分化率下降為9.27%和6.40%。KT濃度為1 mg·L-1時與濃度為1.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1時愈傷分化率差異均達到顯著水平，而KT濃度為1.5 mg·L-1時與2.0 mg·L-1時愈傷分化率差異不顯著。因此，分化培養基中KT濃度選用1.0 mg·L-1時最好。

2.4.22,4-D濃度對愈傷分化率的影響

從表4中可以看出，愈傷分化率隨2,4-D濃度的升高呈先升高后下降的趨勢，當濃度達到3 mg·L-1時，愈傷分化率達到最高(33.35%)，但2,4-D濃度的四個水平所對應的愈傷分化率之間并無顯著差異，結合2,4-D對胚性愈傷率的影響，故應選用2,4-D的濃度為3 mg·L-1。

2.4.3基本培養基對愈傷分化率的影響

從表4可知，3種培養基中，愈傷分化率最高的是MS培養基(26.28%)，其次為N6和B5培養基(分別為16.91%和13.62%)，但MS培養基與N6和B5培養基對應的愈傷分化率之間的差異并不顯著，表明在節節麥愈傷分化過程中三種培養基均可選用，結合基本培養基對胚性愈傷率的影響，應選用MS培養基。

2.4.4碳源對愈傷分化率的影響

四種碳源對應的愈傷分化率間的差異均未達到顯著水平，四種碳源中愈傷分化率最高的是15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇(24.45%)，其次為30 g·L-1蔗糖和30 g·L-1麥芽糖，愈傷分化率最低的是蔗糖+15 g·L-1山梨醇(16.73%)。因此，四種碳源均可選用，為節約成本，可選用蔗糖作為碳源。

表4　不同因素水平下的愈傷分化率及水平間的差異顯著性

3討 論

多數研究者認為，幼胚具有較高的愈傷組織誘導能力和較強的植株再生能力，是一種最有效最理想的外植體來源[12]。小麥幼胚高效再生體系的研究主要集中在幼胚基因型選取、培養基類型以及培養基中添加的激素種類和濃度等方面，并取得了一定的進展[5-10]。在基本培養基的選擇上，大多數研究者認為MS培養基是適合小麥幼胚愈傷組織誘導的培養基，但王新國等[13]對小麥幼胚離體培養的研究發現,在MS、N6B5MS、B5和L3 這4 種培養基中，L3 培養基的出愈率及分化率最高。本研究選用MS、N6和B5三種基本培養基，發現在節節麥幼胚誘導愈傷過程中不同基本培養基對胚性愈傷率的影響程度最大，MS培養基不但愈傷質量最高而且出愈率和胚性愈傷率均最高，其次為N6培養基， B5培養基在愈傷誘導過程中愈傷塊易長出一些毛狀根，從而降低了愈傷質量，因此節節麥幼胚培養適宜選用MS培養基。本研究結果與大部分同類研究相似。在節節麥愈傷分化過程中，MS培養基對應的愈傷分化率最高，但不同基本培養基對應的愈傷分化率之間差異并不顯著。

植物激素是培養基中的關鍵成分之一，其中，2,4-D和KT分別是小麥幼胚愈傷組織誘導和分化階段常用的激素。多數研究者認為，在幼胚培養中2,4-D的適宜用量為2.0 mg·L-1[14-15]。KT的作用是促使細胞分裂，同時使得分裂朝著器官分化的方向進行，不同濃度的KT對小麥幼胚分化有較大影響。本研究結果表明，2,4-D對節節麥胚性愈傷的誘導影響十分顯著，但不同濃度2,4-D對愈傷分化率影響并不顯著。胚性愈傷率和愈傷分化率隨2,4-D濃度的增加呈單峰曲線變化，胚性愈傷率最高時的2,4-D濃度為2 mg·L-1，愈傷分化率最高的2,4-D濃度為3 mg·L-1，這與在普通小麥中的研究結果相似[16-18]。最高的胚性愈傷率和愈傷分化率所對應的2,4-D濃度不同，其原因可能是由于節節麥幼胚在愈傷誘導過程中易長實生芽，適當提高2,4-D濃度有利于抑制實生芽的生成，提高愈傷組織的質量，從而提高愈傷分化率。因此，為提高節節麥幼胚再生率2,4-D濃度宜選用3 mg·L-1。在節節麥愈傷分化的研究中，KT對節節麥愈傷分化率影響最顯著，愈傷分化率隨KT濃度增加而減小，KT濃度為1 mg·L-1時愈傷分化率最高，且與濃度為1.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1時愈傷分化率差異均達到顯著水平。因此，分化培養基中KT濃度宜選用1.0 mg·L-1。

碳源不僅提供愈傷組織生長所需的能量，還起到調節培養基滲透壓的作用。范學科等[12]在小麥幼胚愈傷組織誘導過程中發現，將蔗糖濃度從30 g·L-1降為15 g·L-1，同時加入15 g·L-1的甘露醇或山梨醇，能明顯改善愈傷組織生長狀態。本試驗以30 g·L-1麥芽糖為碳源，胚性愈傷率要高于另外3種碳源，這與Francisco[19]的研究結果相同；以15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇為碳源時，愈傷分化率高于另外3種碳源，但四種碳源之間不論是胚性愈傷率還是愈傷分化率差異都不顯著。因此在碳源的選擇上可以直接選用30 g·L-1蔗糖。

本試驗所研究的16個處理中，節節麥幼胚培養最佳體系為第9個處理，即誘導培養基為MS培養基+ 3.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1麥芽糖，分化培養基為：MS培養基+30 g·L-1麥芽糖+1.0 mg·L-1KT 。而通過正交設計的計算結果，推算出的最佳組合為誘導培養基：MS培養基+3.0 mg·L-12,4-D+15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇；分化培養基：MS培養基+15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇+ 1.0 mg·L-1KT。兩個培養體系之所以有差異是因為本試驗所研究的16個處理是4因素完全正交所對應的144個處理中的一小部分，因此，經推論所得出的結果才是理論上所有處理中最優的節節麥再生體系。

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Establishment of Regeneration System for Immature Embryo ofAegilopstauschii

XU Feng,LI Chunlian,LI Yang,CHAI Guaiqiang,WANG Zhonghua

(Northwest A&F University,College of Agronomy,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:Establishment of a high efficient regeneration system for immature embryo (IEs) of Aegilops tauschii will provide a convenient tool for tissue culture and transformation,thereby facilitating the transformation of foreign genes into wheat. By using the IEs derived from an elite Ae.tauschii ssp. strangulata accession AW1,the effects of some factors,including basal medium,carbon sources,two auxins,2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 6-Furfurylaminopurine (KT),on callus induction and plant regeneration were evaluated. The results indicated that MS basal medium significantly affects the callus induction and differentiation of Ae.tauschii IEs. The concentration of 2,4-D has a significant effect on the capacity of embryogenic callus. The media supplemented with 3.0 mg·L-12,4-D led to the induction of most high-quality embryogenic calli with pale,smooth,and compact nodules. KT played an important role in IEs differentiation. There is no significant difference among the basal medium,2,4-D and carbon source for IEs differentiation. The differences of the effects of carbon source on embryogenic callus induction and differentiation of IEs are not significant and 30 g·L-1sucrose is optimal in practice for cost saving. Overall,culture system of MS+15 g·L-1sucrose+15 g·L-1mannitol +3.0 mg·L-12,4-D is optimal for embryogenic callus induction and culture system of MS+15 g·L-1sucrose+15 g·L-1mannitol is optimal for plant regeneration of Ae.tauschii IEs.

Key words:Aegilops tauschii; Immature embryo culture; Callus induction; Plant regeneration

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)02-0150-07

通訊作者：王中華(E-mail：zhonghuawang@nwsuaf.edu.cn)

基金項目：國家自然科學基金項目(31271794)

收稿日期：2015-10-30修回日期：2015-11-15

網絡出版時間：2016-01-26

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160126.1944.008.html

第一作者E-mail：xufeng100201@163.com