不同流體剪切力對牙周膜成纖維細胞分泌COX-2的影響*

吳　憂， 張軍梅*

(貴州醫科大學附院 口腔科， 貴州 貴陽　550004)

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不同流體剪切力對牙周膜成纖維細胞分泌COX-2的影響*

吳憂**， 張軍梅***

(貴州醫科大學附院 口腔科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究流體剪切力(FSS)對體外培養人牙周膜成纖維細胞(HPDLCs)分泌環氧合酶2(COX-2)蛋白的影響。方法： 體外培養的HPDLCs置于體外FSS加載裝置系統，分別加載0、5、8、12及15 r/min的FSS 1、2及6 h，免疫組織化學染色方法檢測細胞分泌的COX-2蛋白量，分析蛋白量的灰度值。結果： HPDLCs在FSS的作用下COX-2蛋白表達增強，加載力為12 r/min及加載時間2 h 時，COX-2蛋白的表達達峰值。結論： 體外加載FSS可影響人HPDLCs分泌COX-2蛋白。

[關鍵詞]流體剪切力； 環氧合酶2； 牙周膜； 成纖維細胞

合適的正畸力不僅僅可以使得牙齒快速移動，同時還能夠刺激牙槽骨、頜面部等軟硬組織發生不同程度的改建[2]。人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblast，HPDLCs)對機械力的適應性改建是牙齒移動的生物學基礎[1]。研究表明,在正畸過程中，HPDLCs是最先感受到正畸力的細胞，在骨改建的過程中起到了重要的調控作用[3-4]。當機械力引起牙周膜內部液體環境流動產生流體剪切力(fluid shear stress，FSS)后，機械力學信號轉換為生物力學信號，從而使得HPDLCs開始增殖及分化[5]。環氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)是前列腺素E2的限速酶，參與了是前列腺素E2的激活，進而介導細胞力信號作用后骨改建的發生。本研究通過使用平板腔室系統，對體外培養的HPDLCs施加FSS，觀察不同加載力值、不同時間對HPDLCs分泌COX-2的影響，為研究正畸力作用下骨組織改建提供實驗依據。

1材料及方法

1.1主要試劑及器材

DMEM低糖培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清( FBS)、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素購自美國Hyclone公司，Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司，兔抗人波形蛋白和鼠抗人角蛋白購自北京中杉金橋公司，28RS低溫高速離心機和3180FCO2培養箱購自德國Heraus公司，DMIRB倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司，細胞粒度分析及計數儀購自美國Beck-man Coulter公司。

1.2HPDLCs的培養、純化及鑒定

取口腔門診12～16歲患者正畸前磨牙牙冠立即放入預冷的DMEM低糖培養基(含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中快速移至超凈臺，將牙冠取出放入75%乙醇浸泡約1 min，用PBS液反復沖洗離體牙根面去除污物及乙醇，用預先配置的含10% FBS及雙抗的DMEM低糖培養基潤濕根面，刮取根中1/3牙周膜，剪成長、寬、高各約為1 mm的組織塊放入15 mL的離心管中，并加入0.2%Ⅰ型膠原酶2 mL，放入CO2培養箱，每5 min取出搖勻，15 min后800 r/min離心3 min，將消化的組織塊接種于60 mm的培養皿中，加入DMEM低糖培養基(含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)1～2 mL，于CO2培養箱中培養4 h后，再加入上述培養基4 mL繼續原代培養，每3 d換液1次。使用倒置顯微鏡觀察細胞，待組織塊周圍的細胞達到融合狀態時，使用探針將組織塊勾除，向培養皿中加入0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)4 mL，于37 ℃培養箱中消化4～5 min后加入雙倍的完全培養基終止消化，移液槍吹打皿底使細胞脫落后收集于15 mL的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入含15% FBS完全培養基5 mL，將細胞吹打至重懸后接種于培養瓶中繼續培養及純化，每4～5 d換液1次。取第4代細胞通過免疫組化檢查進行細胞鑒定。

1.3繪制HPDLCs生長曲線

取生長至第4代的HPDLCs，使用0.25%的胰蛋白酶消化，離心后棄去上清液，加入含20% FBS的培養基后重懸細胞，以2×105個/mL的量接種于24孔板中，放入培養箱，每2 d對細胞進行1次換液，后每24 h消化3孔對細胞進行計數，取3孔細胞計數的平均值進行計數，連續計數7 d，根據得到的細胞計數繪制細胞生長曲線圖。

1.4體外加載FSS

取培養至第5代的HPDLCs接種于載玻片上，放于加力裝置流動腔室的預備槽中，通過調節蠕動泵上的流速對細胞施加不同的FSS(0、5、8、12及15 r/min)，加載時間分別為1、2及6 h。

1.5檢測HPDLCs中COX-2

取出載玻片，PBS振洗，依次予4%多聚甲醛固定30 min、3% H2O2去離子水孵育、滴加封閉血清孵育、滴加稀釋的COX-2一抗工作液、4 ℃過夜，SP1000通用型二抗，室溫孵育4 h，滴加新鮮配置的DAB顯色劑(DAB底物液1 mL加DAB濃縮液50 μL，混合均勻)，在室溫下置暗處，自來水沖洗，蘇木素復染，沖洗。酒精逐級脫水，充分干燥，樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察COX-2蛋白顆粒染色情況，選取較為清晰的視角使用成像設備拍照用于分析其灰度值。

1.6統計學方法

免疫組化標本經image-pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，每個標本隨機選取10個高倍視野測定其灰度值，灰度值<250為陽性。數據采用SPSS10．5軟件包進行統計分析，兩兩比較采用單因素方差分析中最小顯著差異法(LSD)及單因素多水平方差分析(SNK)，以P<0.05有統計學意義。

2結果

2.1細胞鑒定

對第4代培養HPDLCs細胞進行免疫組化染色顯示，抗波形蛋白呈陽性(細胞內可見大量棕黃色顆粒)及抗角蛋白呈陰性(細胞內未見顆粒，蘇木素染色呈淡藍)，可鑒定為HPDLCs。見圖1。

2.2HPDLCs生長曲線

以細胞計數作為縱軸，細胞培養時間為橫軸繪制HPDLCs生長曲線。從第3天開始，HPDLCs細胞的增殖速度明顯加快，進入到對數生長期，到第7天HPDLCs細胞的數量達到頂峰。見圖2。

波形蛋白(免疫組化)　　　　　　　　　　　　角蛋白(蘇木素)圖1　牙周膜HPDLCs細胞中波形蛋白及角蛋白表達Fig.1　Vimentin and learatin expression in HPDLCs

圖2　牙周膜HPDLCs生長曲線圖 Fig.2　Grouth curre of HPDLCs

2.3HPDLCs中COX-2表達

HPDLCs的COX-2表達因加力的大小與時間不同而不同，未加力組HPDLCs染色后無陽性顆粒顯色,而加力組均呈現不同程度的陽性反應，鏡下可見COX-2均分布于 HPDLCs胞質中，呈棕黃色顆粒存在。4組加力組(5、8、12及15 r/min)加力1 h后，均可見細胞中有少許陽性顆粒出現；加力2 h后，細胞中的棕色顆粒逐漸加深，數量也在增多，其中12 r/min組中陽性率較高，染色顆粒呈深棕色；當加力到6 h后，陽性顆粒較2 h時淺且呈降低態勢，其中15 r/min組的細胞因加力時間過長、力值過大，使得細胞形態發生變化，由正常的長梭形皺縮成偏圓形，見圖3。不同加載力及不同時間 HPDLCs的COX-2灰度值明顯不同，加載1 h時，加載力8 r/min的灰度值最高，其次為15 r/min和5 r/min，12 r/min的灰度值最低；加載2 h時，5 r/min的灰度值最高，其次為15 r/min和8 r/min，12 r/min的灰度值最低；加載6 h時，8 r/min和15 r/min的灰度值為最高值，5 r/min的灰度值表達最低。見表1。

圖3　不同程度加力及時間HPDLCs胞質中COX-2表達Fig.3　The expression of COX-2 in different stress and time in the cytoplasm of HPDLCs

加載力(r/min)加載不同時間HPDLCs中COX-2的灰度值1h2h6h5174.36±1.36 162.81±1.38182.78±1.948188.52±1.65(1)155.84±1.16(1)194.02±1.12(1)12158.48±1.16(1)(2)113.25±1.82(1)(2)187.21±1.32(1)(2)15183.08±1.29(1)(2)(3)157.31±1.48(1)(2)(3)194.14±1.44(1)(3)

(1)與5 r/min比較、(2)與8 r/min比較及(3)與12 r/min比較，P<0.01

3討論

在錯頜畸形矯治的過程中，牙齒移動的基礎是牙周組織的重塑與改建，HPDLCs位于牙周膜中，介于牙齒與牙槽骨之間，在正畸過程中是最先感受到力的細胞[4],通過一些生物化學信號的傳遞開始骨改建。在機械力的刺激下，HPDLCs做出相應的應答，李曉彤等[6]的研究表明，體外對HPDLCs施加機械力，可以檢測出成骨樣細胞蛋白的表達，提示HPDLCs在機械力誘導下向成骨樣細胞分化成熟，從而在正畸力介導的骨改建中發揮作用，調控牙槽骨的形成或吸收。本研究以HPDLCs作為研究對象，檢測其在受到機械應力時的增殖、分化以及主要參與骨改建蛋白的變化，為力學信號在牙周膜中傳導機制及骨改建提供參考。有實驗證明，當正畸力通過牙齒傳導到牙周組織上時，牙周組織會釋放出各種大分子蛋白、酶參加骨改建，已知的有前列腺素E2、IL-1等[7-8]。前列腺素E2是一種非飽和脂肪酸，它可以通過自分泌和旁分泌的方式，與牙周膜細胞進行相互作用，在其不同濃度的情況下，促進破骨過程或成骨過程，使兩種狀態達到一個動態平衡，從而參與牙槽骨的改建。COX-2是花生四烯酸(AA)合成前列腺素E2的限速酶，參與了前列腺素E2的激活，進而介導了細胞力信號作用后骨改建的發生。研究證明，COX-2和前列腺素E2是機械應力刺激骨改建所必需的，選擇性抑制COX-2表達，可以阻斷機械應力誘導的體內骨的形成；在生理過程中，HPDLCs不分泌COX-2，而對體外培養的HPDLCs施加FSS，可以促使HPDLCs分泌COX-2[9]。

體外培養細胞的力學實驗根據不同的施加方式，可分為：壓力載荷法、機械拉伸法、流體剪切法和離心力培養法等[10-14]。Schwarz[15]認為牙周膜組織是個連續的液態環境，組織液即細胞物質交換的媒體又是傳遞和緩沖應力的介質。當牙齒受力發生位移時，必然擠壓牙周膜引起組織液的液壓迅速改變。有學者認為，細胞對FSS的反應比對壓力及牽張力的反應敏感得多，細胞對外力的反應是因為外力導致組織間液流動改變，從而被細胞感知[16]。FSS具有明確而恒定的方向性，使得受力的細胞發生相應的排列改變[17]。靜壓力由于沒有明顯的方向性，所以不能改變細胞的排列方向。周期性牽張力的動態效果也造成細胞貼壁不牢，細胞骨架收縮，細胞體積變小[18]。就牙周的應力環境來看，體外施加FSS更能模擬整個牙移動時牙周膜所受到的機械力。本研究使用的流體剪切力加力裝置通過精密的計算，可將加載的流體轉算轉換成離體細胞所受到的具體力值大小。通過對體外培養的HPDLCs施加不同大小和不同加載時間的FSS，檢測HPDLCs中COX-2蛋白的表達變化，以尋找誘導HPDLCs在牙移動的整個骨改建過程中發揮作用的最佳作用力值和產生作用時間，加載力為12 r/min、加載時間2 h時，COX-2蛋白的表達最高，通過公式平均剪切力τ= 6ηQ/h2w計算得出FSS為46.00 g。46.00 g，2 h 的加載條件有利于研究HPDLCs在正畸牙移動的整個骨改建過程中的作用，為研究正畸力作用下骨組織改建提供實驗依據。

4參考文獻

[1] Pro P,Pmer P.The molecular mechanism behind bone remodeling a review[J]. Clin Oral Investing， 2009(4)：355-362.

[2] Xie R, Kuijpers-Japtman AM, Maltha JC. Osteodast differentation and recruitment during early stages of experimental tooth movement in rats[J].Oral Sd, 2001(117):43-50.

[3] 杜紅江，陳學鵬，嚴洪海.丹參對人牙周膜成纖維細胞骨保護素表達的影響[J].上海口腔醫學， 2010(5):530-534.

[4] 賈瑩, 陳波, 廖健, 等.間歇性張應力對牙周膜成纖維細胞蛋白合成功能的影響[J].貴陽醫學院學報， 2005(1)：30-33.

[5] 張廣道,洪巖松,艾紅軍.纖維粘連蛋白與流體剪切力對體外培養的牙周膜成纖維細胞COX-2表達的影響[J].上海口腔醫學, 2007(3):290-295.

[6] 李曉彤，張丁，傅民魁，等.機械牽張力對牙周膜成纖維細胞成骨樣細胞功能的影響[J].中華口腔醫學雜志， 2002(2)：135-138

[7] Rosenberg N．The role ofthe eytoskeleton in mechanotransduction in hum osteoblast-like cells[J]．HuIll Exp Toxicol， 2003(22)：271-274．

[8] 袁琳，周偉東.力增強影響大鼠牙周組織前列腺素(PGE2)表達變化的研究[J].臨床口腔醫學雜志, 2008(3):133-135.

[9] 駱泉豐，王興.PGE2在骨生成和骨改建中的作用[J].現代口腔醫學雜志， 2005(9):518-521.

[10]魏志剛.口腔正畸過程生物力學建模仿真研究[J].中國生物醫學工程學報， 2009(28):226-230.

[11]Von den Hoff JW．Efiects of mechanical tension on matrix degradation by human periodontal ligament ceils cultured in collagen gels[J]．Periodontal Res， 2003(5)：449-457.

[12]Yamaguchi M，Shimizu N，Ozawa Y，et al．Effect of tension-force on plasminogen activator activity from human periodontal ligament cells[J]. Periodontal Res, 1997(32)：308-314．

[13]Redlich M，Asher Roos H，Reichenberg E，et al．Expression of tropoelastin in human periodontal ligament fibroblasts after simulation of orthodontic force[J]．Arch Oral Bi, 2004(49):119-124.

[14]Bolcato-BeIlemin AL，Elkaim R，Abehsera A，et al．Expression of mRNAs encoding for alpha and beta integrinsubunits，MMPs，and TIMPs in stretched human periodontal ligament and gingival fibroblasts[J]．Dent Res, 2000(79)：1712-1718．

[15]Qu Q，Perala-Heape M，Kapanen A，et al．Estrogen enhances differentiation of osteoblasts in mouse bone marrow culture[J].Bone, 1998(209):201-209.

[16]Chandrasekharan NV，Dai H，Roos KL，et al．COX-3，a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs： cloning， structure， and expression[J]．Proc Natl Acad Sci USA, 2002(21)：13926-13931．

[17]楊美祥.不同應力對人牙周膜成纖維細胞細胞骨架影響的體外研究[J].中國臨床康復, 2005(23):3162-3164.

[18]韓文利，陳新民.機械拉伸下人牙周膜成纖維細胞增殖動力學變化的研究[J].華西醫科大學學報, 2000(31)：149-151.

(2016-01-15收稿，2016-03-28修回)

中文編輯： 戚璐； 英文編輯： 劉華

Effect of Different Fluid Shear Stress on Protein Expression of COX-2 Secreted by HPDLCs

WU You, ZHANG Junmei

(DepartmentofStomatology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the effect of fluid shear stress (FSS) on the cyclooxygenase2 (COX-2) secreted by human periodontal ligament fibroblast (HPDLC) cultured in vitro. Methods: The HPDLCs cultured in vitro were placed in flow chamber system of fluid shear stress (FSS) and 0, 5, 8, 12 and 15 r/min of fluid shear stress were applied to HPDLCs for 0 h, 1 h, 2 h and 6 h, respectively. The immunohistochemistry was used to detect the expression level of COX-2 protein secreted by HPDLCs, and gray value of protein quantity was analyzed. Results: Under the action of fluid shear stress (FSS), expression of COX-2 protein in human periodontal ligament fibroblast (HPDLF) was enhanced. And when 12 r/min was applied for 2 h, the expression level of COX-2 protein reached the peak. Conclusion: The application of fluid shear stress (FSS) in vitro can affect the expression of COX-2 protein secreted by human periodontal ligament fibroblast (HPDLF).

[Key words]fluid shear stress; cyclooxygenase 2; periodontal ligament; fibroblast

[中圖分類號]R783.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0441-05

*[基金項目]貴陽市科技局基金[筑科合同(20151001)]

**貴州醫科大學2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:zjm46688@126.com

網絡出版時間：2016-04-20網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1834.040.html