海南島益智種質資源表型變異及ISSR分析

王祝年 邱燕連 晏小霞 陳永鋒 葉才華

摘 要 對海南島72份益智種質的遺傳多樣性進行系統評價。利用相關分析、主成分分析探究各表型性狀的相互關系，結合表型性狀及ISSR標記研究資源的遺傳多樣性。結果表明：不同益智種質的各種性狀均存在變異，所調查的14個性狀可歸類為營養器官、產量、果實形態等3個部分，各部分平均變異系數表現為CV產量（0.464）>CV營養器官（0.143）>CV果實形態（0.121）。性狀相關分析中，91對性狀組合中有34對呈極顯著相關。主成分分析前7個主成分積累貢獻率達到89.29%，前3個貢獻率最大的主成分積累貢獻率達到64.86%，單果體積因子第一，產量因子第二，單果形態因子第三。經基于表型性狀的聚類分析，72份樣本可分為9組。利用20條ISSR引物對68份益智種質材料基因組DNA進行研究，共擴增出466條條帶，其中446條為多態性帶，占總條帶的95.71%；當相似系數為0.762時，68份樣本被分為6組，其中42.65%的樣品被分到第Ⅲ組。依據ISSR標記的聚類與表型性狀的表現并不完全一致，這可能是由于DNA結構差異不一定在表型性狀上得到相應表現，本研究所調查的表型性狀只是益智表型性狀的一部分，而ISSR標記所分析的位點則覆蓋整個基因組。

關鍵詞 海南島；益智；表型性狀；ISSR；聚類分析

中圖分類號 Q949.71+8.33 文獻標識碼 A

益智（Alpinia oxyphylla Miquel）屬姜科山姜屬植物，為中國四大南藥之一，主產于中國海南，廣東、云南、廣西、福建亦有少量栽培。益智以干燥成熟果實入藥，已有悠久的藥用歷史，其性溫味辛，具有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾的功能[1]。此外，益智還是極有開發價值的香料植物，已被廣泛應用于保健食品和藥膳等，屬藥、香、食同源植物，具有廣泛的研究和應用價值，已開發出系列產品。

近年來，學者們陸續對益智進行了相關研究，取得了很大的進展，研究范圍包括化學成分[2-4]、藥理[5-7]、栽培技術[8]、組織培養[9]、遺傳多樣性[10-11]、食品開發[12-14]等多方面的內容，但關于益智遺傳育種方面的研究尚未見報道。海南島益智主要為農戶自發引種栽培，各地間種質資源交流頻繁，遺傳變異復雜，遺傳背景不明，尚未有專門的機構對其進行深入研究，基于此，本課題以海南島益智種質資源為材料，結合形態標記和ISSR分析，開展海南島益智種質資源的遺傳多樣性研究，旨在為益智的遺傳改良和生產應用以及海南島益智種質資源的保護和合理利用提供科學依據。

表型變異是基因型與環境共同作用的結果，可在一定程度上反映生物遺傳變異的程度，是理解物種適應機制的重要方法[15]。ISSR（inter-simple sequence repeats）簡單序列重復區間擴增多態性是由Zietkiewicz等[16]于1994年提出的一種以PCR（polymerase chain reactiong，聚合酶鏈式反應）擴增為基礎的分析標記技術，被廣泛應用于居群遺傳學、品種鑒定、物種分類以及物種的遺傳多樣性研究中[17-19]。

1 材料與方法

1.1 材料

本課題于2014年5～6月對海南島5個地區8個居群72份益智種質材料性狀進行觀測。各個采集地的地理位置、經緯度、海拔高度、生境特點和樣本數見表1，由于各種原因，部分樣品被他人提前收走，未能獲得數據，導致各居群樣本數不一致。居群中除SY1（三亞鳳凰嶺居群）為純野生居群外，其余均為栽培居群。

1.2 方法

1.2.1 表型性狀的數據處理 每叢為一份種質材料（或稱樣品），各表型性狀皆以測量該性狀的最長（寬）處為準，株高、莖桿直徑、果穗重、果序長、座果率等性狀每叢測10個重復并取其平均值；每份樣品取30粒正常發育的單果，用游標卡尺測量果長、果寬。采集地點的地理因子用手持GPS定位儀記錄。

1.2.2 ISSR分析 從上述72份種質材料中，取68份（分子標記材料缺HM2-3、LM1-1、QS1-3、QS2-6）材料；采用改良的CTAB法[20]提取益智嫩葉總DNA，并利用紫外分光光度計（島津UV-2700）檢測DNA的純度和濃度，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，最后將每一份樣本DNA稀釋至50 ng/μL，于-20 ℃保存備用。ISSR引物為哥倫比亞大學（UBC）公布的100條引物序列，由美國生命技術公司廣州合成部（life technologies）合成。從確定的反應體系中篩選出20條多態性好及擴增條帶清晰的引物用于后續試驗。ISSR反應體系為：10×PCR buffer（Mg2+plus）3.0 μL，模板DNA（50 ng/μL） 1.0 μL，引物（100 μmol/L）1.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，加ddH2O補足至20 μL，總反應體積為20 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共36個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增反應在德國Biometra公司生產的T1 PCR擴增儀上進行，PCR反應結束后取7 μL PCR產物與1 μL 6×loading Buffer混勻，點入15 g/L瓊脂糖凝膠（每100 mL加入5 μL GoldViewTM DNA染料）中，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓90 V，電泳約40～50 min；電泳結束后在凝膠成像系統中觀察并拍照。

1.3 數據處理

用Excel軟件對所獲得的表型性狀數據進行統計，以變異系數CV（標準差/平均值）作為各形態性狀變異的測度；運用SPSS19.0軟件對形態數據經標準差標準化后進行系統聚類。以擴增條帶在相對遷移位置的有無，記為“1”或“0”，用NTSYS-PC2.1對擴增條帶數據進行分析，通過類平均法（UPGMA）對68份種質進行遺傳相似性聚類。

2 結果與分析

2.1 表型性狀多樣性

樣品形態性狀指標的分析結果（表2）表明，72份益智材料的14個性狀均存在一定程度的變異，變異系數為0.089～0.821。14個性狀可歸類為營養器官、產量、果實形態等3個部分。營養器官部分包括株高、莖桿直徑2個性狀。株高的變異幅度呈中等大小，從138～385 cm不等；莖桿直徑變異幅度較株高小。產量部分主要包含莖桿總數、結果桿數、單株產量、果穗重、果序長、座果率、單果重等7個性狀。單株產量是所有性狀中變異程度最大的，變異系數為0.821，同時受到其余6個性狀的影響。果實形態包括果長、果寬、單果大小（果長×果寬）、單果形態（果長/果寬）及果頂端形態等5個性狀，在野外調查及觀測中，常見到果實有大、中、小及長、圓之分。按大小可粗略將益智果實分為大果、中果、小果，按形態可分為圓果、橢圓果，果頂端形態有鈍和尖2種形態。圓果型果實的果長/果寬接近于1，但絕不小于1，果粒之間排列緊密，互相擠壓；橢圓果型果實的果長/果寬大于1，果粒之間排列較為疏松，果粒之間不互相擠壓；果長/果寬越大，果實越長，排列越疏松。在所調查到的樣品中，果長/果寬范圍為1.041～1.965，比值小的極近于球形，比值大的果長較果寬長近2倍。由于果頂端形態為質量性狀，因此未計算其變異系數，3個部分平均變異系數表現為CV產量（0.464）>CV營養器官（0.143）>CV果實形態（0.121），果實形態的變異較小，說明其指標有一定的遺傳穩定性。

2.2 益智表型性狀的相關性

72份益智樣品14個性狀間表現出不同程度的相關性（表3）。91對性狀組合中有34對具有顯著相關關系。單株產量分別與莖桿總數、結果桿數、果穗重、座果率呈極顯著正相關，果穗重分別與果序長、單果大?。üL×果寬）呈極顯著正相關，結果桿數分別與莖桿總數、座果率呈極顯著正相關，果序長分別與單果重、單果長呈極顯著正相關，單果大小分別與單果重、果序長、果長、果寬呈極顯著正相關，單果形態（果長/果寬）分別與果頂端形態、果長呈極顯著正相關，與果寬呈極顯著負相關，果頂端形態與果寬呈極顯著負相關。

2.3 主成分分析

對14個表型性狀進行主成分分析的結果（表4）表明，前7個主成分積累貢獻率達到89.29%，基本可以包含14個性狀所含有的信息。第一主成分貢獻率為24.49%，對它影響最大的性狀包括單果大?。?.486 687）、單果重（0.451 349）、果長（0.382 861）、果寬（0.340 678），該成分與單果的體積有關，可以稱為單果體積因子；第二主成分貢獻率為21.60%，對它影響最大的性狀包括單株產量（0.513 016）、果穗重（0.424 571）、結果桿數（0.389 807）、莖桿總數（0.350 040）、果序長（0.295 520）、座果率（0.222 168），該成分與產量有關，可以稱之為產量因子；第三主成分貢獻率為18.76%，對它影響最大的性狀包括單果形態（果長/果寬）（0.575 507）、果頂端形態（0.453 547）、單果寬（-0.411 844）、單果長（0.368 941），該成分與形態有關，可以稱之為單果形態因子；第四、五、六、七主成分貢獻率較小，分別為7.23%、6.72%、5.65%、4.84%，對第四、六主成分影響最大的性狀都是株高，對第五主成分影響最大的性狀為莖桿直徑，株高與莖桿直徑都為營養器官，因此可以將第四、五、六3個主成分統稱為營養器官因子；對第七主成分影響最大的為果序長，屬于產量因子。

2.4 益智種質資源表型性狀的聚類分析

用SPSS19.0軟件對72個供試材料進行聚類分析，獲得基于表型性狀的樹狀圖（圖1）。在距離值為13時，72個樣品被分為9組，其中組Ⅰ與組Ⅱ相近，組Ⅴ、組Ⅵ、組Ⅶ相近，組Ⅷ、組Ⅸ相近，各個采集地的樣品分散在各個組里。經分析各組信息后，將單果分為大果、中果、小果，小果單果重為0.60～1.20 g；中果單果重為1.20～1.65 g，大果單果重為1.65～2.10 g；產量分為3個級別，果穗重與單株產量接近總體平均值的設為中等，遠低于總體平均值的設為產量較低，遠高于總體平均值的設為產量較高。據實際測量及觀察的結果可設定，當果長/果寬在1.0～1.2時，果近于圓形；當比值在1.2～1.4時，果略呈橢圓形；當比值在1.4～1.6時，果呈橢圓形；當比值在大于1.6，果呈長橢圓形。各組特點見表5。

2.5 ISSR分析

取68份益智種質材料的分子材料并用20條引物對其進行PCR擴增，部分引物擴增結果見圖2，大部分擴增片段大小在200～1 500 bp。20個ISSR引物共擴增出466條譜帶，其中多態性條帶為446條，多態性比例（PPB）為95.71%（表6），表明益智種質材料具有豐富的遺傳多樣性，ISSR標記可很好地揭示供試益智種質材料的遺傳差異和親緣關系。采用UPGMA方法對數據進行聚類分析，得到益智種質材料的ISSR聚類圖（圖3），由圖3可見，68份樣品相似系數在0.72～0.86，表明群體遺傳多樣性水平不高，來自各個群體的樣本基本上按照采集地點聚在一起。在相似系數0.762水平上，68份樣品被分為6組。第Ⅰ組有12份樣品，包括DZ1的10份樣品和HM1的2份樣品。第Ⅱ組有18份樣品，包含HM1的7份樣品，HM2的6份樣品，DZ1的2份樣品，LM1的2份樣品，LM2的1份樣品，本組各居群樣品比較分散。第Ⅲ組有29份樣品，包含LM1的1份樣品，LM2的8份樣品，QS1的10份樣品，QS2的10份樣品。第Ⅲ組在相似系數0.772水平上又可分為4個亞組，分別為A、B、C、D 4個亞組，A亞組包含LM1的1份樣品；B亞組有14份樣品，包含LM2的8份樣品，QS2的1份樣品，QS1的5份樣品；C亞組包含QS1的3份樣品；D亞組有11份樣品，包含QS1的2份樣品，QS2的9份樣品。各居群中以LM2及QS2的樣品較為集中，QS1的樣品較為分散。第Ⅳ組有2份樣品，包含HM2的1份樣品和LM1的1份樣品。第Ⅴ組為HM2的2份樣品。第Ⅵ類為SY1的5份樣品。從總體看，各樣品主要按來源聚在一起，其中以SY1、DZ1、LM2、QS2的樣品較為集中，LM1、QS1、HM1、HM2的樣品較為分散。SY1的樣品（野生）全部集中在一個類群中，并與其他樣品（野生撫育）最早在相似系數0.72水平上被分成2大類群，可見，SY1的野生居群與其余栽培居群具有較大的遺傳差異。

3 討論與結論

在野外調查及測量中發現，益智各表型性狀均存在各種變異，如株高、桿圍、葉形、果序長等均呈連續型的變異，較為明顯且易于分辨及歸納的為果實性狀，常見到果實有大、中、小及長、圓之分，果序長短差異較大，但在同一叢中各性狀表現均較為一致。本研究利用SPSS19.0軟件對收集到的益智形態數據進行聚類分析，72個樣品被分為9組，將表型性狀較為接近的材料很好地聚在一起。

主成分分析可以將多個相關指標綜合成較少的相互獨立或不相關的新指標，并保持絕大部分的信息量。本研究經主成分分析綜合得到7個主成分，積累貢獻率達到89.29%，其中前3個貢獻率最大的主成分積累貢獻率達到64.85%，單果體積因子第一，產量因子第二，單果形態因子第三。

本研究中，利用ISSR分子標記對68份益智種質材料進行分析，采用UPGMA方法對數據進行聚類分析，結果顯示68份樣品相似系數在0.72～0.86，來自各個群體的樣本基本上按照采集地點聚在一起，可以看出，ISSR分子標記聚類具有很高的靈敏度，能夠準確地將來自不同采集地點的樣本聚在一起。

本研究中，依據ISSR標記的聚類與表型性狀的聚類結果不完全一致，在表型分析中散布在各組的SY1種群，在ISSR標記聚類中全部聚成一組，而在ISSR標記中親緣關系較近的DZ1-6和LM1-4在表型分析中則相距較遠。

本研究首次將益智種質資源的ISSR分子標記與表型性狀的聚類進行對比分析，旨在探索分子標記聚類方法與表型性狀的聚類是否一致，并通過2種方法的結合對海南島益智種質資源進行更為合理的鑒定與分類，然而2種聚類方法的結果并不完全一致。其原因可能在于：（1）所采用的72份益智種質資源材料均為自然授粉的地方品種， 遺傳背景較復雜；（2）表型性狀是基因與環境間、基因與基因間互作的結果，分子標記揭示的是物種在DNA序列上的差異，因此，DNA結構差異不一定在表型性狀上得到相應表現，即使能夠表現，其表現的形式也可能因為基因間的互作或調控而呈現多種多樣，這也是許多作物中表型分類與分子標記分類不完全一致的主要原因[21-23]；（3）也可能是由于本研究所調查的表型性狀只是益智所有表型性狀的一部分，而ISSR標記所分析的位點則覆蓋整個益智基因組；（4）試驗研究結果也受到研究者習慣的影響，不同的研究者得出的結果可能不完全一致。同時，本研究表明，當供試材料形態相近時，表型聚類分辨能力有限，而ISSR分子標記聚類則具有更高的靈敏度，能夠準確地將來自不同采集地點的樣本聚在一起。因此，運用分子標記技術研究益智地方群體種質的遺傳多樣性，可以不受環境、發育時期和器官等的限制，從基因組水平上揭示其遺傳變異的程度，且在早期就可進行新品種的鑒定。

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