木薯試管塊根誘導技術研究

嚴華兵 周慧文 曾文丹

摘 要 以木薯主栽品種‘華南205組培苗為材料，利用正交實驗設計L9（34）分析蔗糖濃度、萘乙酸（NAA）、多效唑（PP333）和茉莉酸甲酯（MeJA）對木薯試管塊根誘導的影響，篩選適宜木薯試管塊根誘導的培養(yǎng)基配方，并對較優(yōu)配方組合進行驗證試驗和根系內(nèi)淀粉粒觀察。結果表明：木薯試管塊根誘導較優(yōu)的配方為1/2 MS+6-BA 0.02 mg/L+0.1 mg/L PP333+0.02 mg/L NAA+10 μmol/L MeJA+50 g/L蔗糖+6.3 g/L瓊脂。在該配方誘導條件下，組培苗生根率達80%以上，組培苗形成的根系增粗明顯，塊根內(nèi)有豐富的淀粉顆粒形成。PP333在木薯試管塊根誘導和增粗中起著重要作用。本研究成功獲得了較優(yōu)的木薯試管塊根誘導培養(yǎng)基配方，為木薯塊根發(fā)生發(fā)育機理和育種研究奠定了基礎。

關鍵詞 木薯；試管塊根誘導；蔗糖；植物生長調節(jié)劑

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A

木薯（Manihot esculenta Grantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，耐旱抗貧瘠，廣泛種植于非洲、美洲和亞洲等100余個國家或地區(qū)，是世界三大薯類作物之一[1]。木薯用途廣泛，可食用、飼用和加工成各種工業(yè)產(chǎn)品，如淀粉、酒精等[2]。木薯主要在中國廣西、云南等熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛種植，但產(chǎn)量供不應求，平均產(chǎn)量較低。木薯是以地下貯藏塊根為主要經(jīng)濟收獲器官，所以研究木薯貯藏塊根發(fā)生發(fā)育具有重要意義。由于木薯塊根的發(fā)育和成熟需要6～10個月，且塊根生長在土壤中，研究觀察耗時長且不方便取材[3]；通過在離體培養(yǎng)條件下誘導試管塊根，是研究木薯塊根發(fā)生發(fā)育和形成機理的一個重要途徑。有關試管塊根或薯的誘導主要集中在馬鈴薯、山藥等作物，而木薯試管塊根誘導研究報道較少。Medina等[4]曾研究細胞分裂素、生長素等因素對木薯試管塊根形成的影響，并對誘導產(chǎn)生的試管塊根進行了解剖學和形態(tài)學的比較研究。Fan等[5]也開展了木薯試管塊根誘導相關研究，在添加0.5 mg/L BA和0.5 mg/L NAA的條件下，60 g/L蔗糖濃度有利于木薯試管塊根誘導。另外，木薯試管塊根誘導的研究工作大多采用單因子分析法，這種方法效率較低，也不能探究各個因子的交互作用。本試驗采用四因素三水平L9（34）正交實驗設計方法研究蔗糖、萘乙酸（NAA）、多效唑（PP333）和茉莉酸甲酯（MeJA）4個影響因子對木薯試管塊根形成和植株形態(tài)的影響，探索誘導木薯試管塊根的較優(yōu)配方和不同因素對木薯植株生長形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木薯品種‘華南205。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體材料 采用木薯品種‘華南205無菌組培苗單芽莖段，單芽莖段在MS+6-BA 0.01 mg/L+NAA 0.02 mg/L+蔗糖20.0 g/L的固體培養(yǎng)基中繼代增殖，繼代周期為45 d。

1.2.2 木薯試管塊根誘導 選擇蔗糖濃度、萘乙酸（NAA）、多效唑（PP333）和茉莉酸甲酯（MeJA）作為試驗因子，每個因子設置3個水平，采用L9（34）正交設計表設計實驗，具體設計方法如表1所示，試驗共有9個處理，其中處理1為對照（CK）。試驗結束后，根據(jù)統(tǒng)計結果挑選出較優(yōu)的處理進行驗證試驗。通過進一步驗證實驗的結果和淀粉粒觀察比較確定最優(yōu)配方組合。上述試驗所使用的培養(yǎng)基均為固體培養(yǎng)基，由MS基本培養(yǎng)基和添加的6.3 g/L瓊脂、6-BA 0.02 mg/L以及表1中不同激素和蔗糖所組合而成。所有培養(yǎng)基均將pH值調至5.8～6.0后滅菌。

1.2.3 試管塊根淀粉顆粒觀察 取木薯組培苗根系，放入鼓風干燥箱內(nèi)50 ℃烘干，將烘干后的組培苗根系在研缽內(nèi)碾碎，取碾碎后的樣品0.5 g，以10～20倍蒸餾水均勻分散成懸濁液，加入3～4滴碘液染色。取1滴（約0.05 mL）懸濁液涂抹于載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕揉按以使顆粒分布均勻，在光學顯微鏡奧林巴斯BX-10下觀察拍照。

1.2.4 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度（27±1）℃，光照強度為2 000 lx，光照時間12 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各處理設3個重復，每個重復接種5瓶，每瓶接種6個無菌單芽莖段，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)。

統(tǒng)計指標為：生根率、株高、最長根長、繁殖系數(shù)、平均根粗、最粗根粗、莖鮮重和干重、根鮮重和干重以及收獲指數(shù)。

生根率=生根組培苗數(shù)目/接種的組培苗數(shù)目×100%

株高和最長根長用直尺測量；根粗用數(shù)顯游標卡尺測量根部最粗處；干重為材料在恒溫烘箱中50 ℃烘至恒重后稱量重量的平均值；收獲指數(shù)=根鮮重/全株鮮重；所有試驗數(shù)據(jù)為3次重復的平均值，結果均以“平均值±標準誤差”的形式表示。

采用軟件SAS和Excel 2007對數(shù)據(jù)進行處理、統(tǒng)計與分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理中植株形態(tài)的差異

經(jīng)過45 d離體的培養(yǎng)，生長在9種處理培養(yǎng)基的組培苗有顯著的形態(tài)差異（圖1）。從圖1和表2可以看出，CK生長正常，株高、最長根長、生根率和繁殖系數(shù)均是最高。與CK相比，其余8個處理對組培苗的生長存在不同程度的影響。在9個處理中，處理8的平均根粗和最粗根粗最大。從收獲指數(shù)來看，不同處理對組培苗莖和根生長影響差異較大，CK的收獲指數(shù)最低，收獲指數(shù)最高的發(fā)生在處理9組合。

2.2 各因子水平變化對試管塊根誘導和植株生長的影響

從極差分析結果（表3）可以看出，各因子水平變化均對木薯試管塊根誘導和植株生長產(chǎn)生明顯影響。從極差結果來看，PP333對平均根粗和最粗根粗的影響最大，其次是MeJA、蔗糖、NAA。使用最高水平的PP333濃度（0.1 mg/L）時，組培苗的平均根粗最大；說明高濃度PP333可以使木薯根部有效增粗。PP333和蔗糖對株高的影響相近，其次是NAA，影響最小的是MeJA。PP333或蔗糖添加濃度越高，組培苗越矮小。對生根率影響最大的是NAA，NAA濃度越高，組培苗生根率越低。

2.3 最優(yōu)配方組合的初步篩選

從表2可以看出，從生根率來看，處理5、7、9的生根率均不超過20%，顯著低于其它處理。處理3和處理6生根率僅50%左右，且它們的繁殖系數(shù)、最粗根粗和平均根粗較低。因此，本研究選擇處理2、4、8進行驗證試驗，處理1作為對照。

2.4 最優(yōu)配方組合的驗證試驗

表4表明，驗證實驗結果與正交試驗結果略有不同，但總體一致。從組培苗平均根粗和最粗根粗來看，處理4和處理8最高，顯著高于對照和處理2。

2.5 試管塊根淀粉顆粒觀察

淀粉粒觀察結果如圖2所示（淀粉粒呈紫色）。從圖2可以看出，4個處理的根系經(jīng)碘液染色在光學顯微鏡40倍物鏡下，1號處理只能觀察出極少量的淀粉粒；2號處理可觀察出大量淀粉粒，4號處理可觀察到少量大顆粒淀粉粒，8號處理的淀粉粒較小，很難觀察到淀粉粒，但在100倍物鏡下，可以觀察出有豐富的淀粉粒形成。

結合組培苗生長形態(tài)、根系形態(tài)和淀粉顆粒形成觀察結果來看，處理2內(nèi)有大量淀粉粒產(chǎn)生，但根系增粗不明顯；處理4的平均根粗有一定增加，但淀粉粒數(shù)量少；處理8的組培苗根系增粗明顯，且產(chǎn)生大量淀粉粒。因此，本研究認為處理8為較優(yōu)的誘導試管塊根配方，具體配方為：1/2 MS+6-BA 0.02 mg/L+0.1 mg/L PP333+0.02 mg/L NAA+10 μmol/L MeJA+50 g/L蔗糖+6.3 g/L瓊脂。

3 討論與結論

本試驗采用正交實驗設計方法探討不同因素對木薯試管塊根誘導的影響，該方法已被前人廣泛應用到馬鈴薯[6-7]、山藥[8-9]的試管結薯實驗中，但還未見在木薯中的應用報道。在以往的木薯試管塊根誘導中[4-5，10]，采用的多為單因子實驗方法，這種方法需要根據(jù)每一個因子設置實驗，費時費力，且不能考慮因子之間的交互作用。本實驗采用正交實驗設計方法，優(yōu)點是省時省工，缺點是不能具體考察某個因素對實驗結果的具體影響，因為在應用正交實驗設計方法的實驗體系中，所得出的實驗結果皆為幾個因素共同導致的。筆者通過本次正交設計實驗，快速得到了實驗結果，并且彌補了應用正交實驗設計方法誘導木薯試管塊根研究報道中的空白。

以往的研究，PP333被廣泛應用于誘導試管塊根或試管薯。豐鋒等[11]研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的PP333有利于山薯試管塊根的形成。肖關麗等[12]研究表明，高溫長日照抑制馬鈴薯試管薯形成，但高溫長日照條件下，馬鈴薯試管薯可以在添加PP333的培養(yǎng)基中形成，其機理是PP333可調節(jié)內(nèi)源激素質量分數(shù)，逆轉高溫長日照對塊莖形成的抑制作用。張翠萍等[13]研究也發(fā)現(xiàn)PP333可以成功誘導彩色馬蹄蓮組培苗在試管中結球。本研究發(fā)現(xiàn)，PP333對根粗的增加起到明顯促進作用，生長在添加高濃度PP333的培養(yǎng)基的組培苗根系顯著增粗，但植株生長受到明顯抑制；這與張勝珍等[14]和褚明宇等[15]研究結果十分相似。茉莉酸（JA）及其衍生物，在誘導山藥和馬鈴薯試管塊根中已被較多的應用[8，16-17]。杜紅梅等[18]研究結果表明，MeJA可以提高香酥芋的子球鮮重、干重和干物質含量，其推測機理可能是影響成球過程中貯藏物質的積累。目前關于MeJA對木薯試管薯誘導影響的研究甚少，據(jù)了解，本試驗是第一次使用MeJA作為誘導木薯試管薯的試驗因子。通過極差分析，發(fā)現(xiàn)MeJA對木薯組培苗的平均根粗和收獲指數(shù)的影響較大，因此建議今后可開展關于MeJA對木薯塊根生長調控影響的研究。而本試驗中還觀察到，有的淀粉粒較大，有的較小。推測可能是植物生長調節(jié)劑水平和種類的不同影響了組培苗根系的淀粉粒累積形態(tài)，具體原因有待進一步探討研究。在姚遠[10]的研究中，有單粒淀粉粒和復粒淀粉粒2種形態(tài)。

本試驗在離體條件下成功誘導了木薯試管塊根發(fā)生。以試管塊根替代田間薯塊，將可能有利于離體條件下探討木薯塊根形成和發(fā)生發(fā)育機理，研究不同外源條件如植物生長調節(jié)劑等對木薯塊根形成的影響；也利于在木薯淀粉品質改良育種中，可作為木薯育種輔助技術，并在離體條件下觀察淀粉粒形成和結構變化。

木薯試管塊根誘導較優(yōu)的配方為1/2 MS+6-BA 0.02 mg/L+0.1 mg/L PP333+50 g/L蔗糖+0.02 mg/L NAA+10 μmol/L MeJA+6.3 g/L瓊脂。該配方誘導條件下，組培苗生根率達80%以上，組培苗形成的根系增粗明顯，根內(nèi)有較多淀粉顆粒形成。木薯試管塊根可為木薯塊根發(fā)生發(fā)育機理和育種研究奠定基礎。

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