‘紅肉蜜柚’果實汁胞粒化與不同組分POD活性的關系

徐世榮　潘鶴立　吳嘉玲　宋敏娜　李小婷　張智偉　余磊　潘東明

摘 要 為了研究‘紅肉蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck. cv. Hongrou miyou]果實汁胞粒化過程中不同結合態過氧化物酶（POD）的變化，以及赤霉素處理對此的影響。以赤霉素處理和未經赤霉素處理的‘紅肉蜜柚果實的近中柱和遠中柱汁胞為材料，統計粒化指數后，進行POD提取體系篩選與酶活測定。發現‘紅肉蜜柚果實汁胞粒化指數逐漸上升，有無赤霉素處理無明顯變化；可溶性POD最佳提取體系為pH8.0，0.1 mol/L Tris-HCl的緩沖液；離子結合POD的為含0.1% Triton和1 mol/L NaCl的pH8.0，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液；未檢測到共價結合POD活性。此外，可溶性、離子結合POD活性在生長發育過程中整體呈下降趨勢，且無論是否經赤霉素處理，近中柱與遠中柱汁胞的可溶性POD活性均存在極顯著差異（p<0.01），而離子結合POD活性均無顯著差異（p>0.05）；無論近中柱或遠中柱，有無赤霉素處理的可溶性POD均存在極顯著差異（p<0.01），而離子結合POD活性僅在遠中柱汁胞中有極顯著差異（p<0.01）。所以，可溶性POD可能與汁胞粒化關系密切，而離子結合、共價結合POD和赤霉素對汁胞粒化的影響有待進一步研究。

關鍵詞 ‘紅肉蜜柚；粒化；POD活性；赤霉素

中圖分類號 S666.3 文獻標識碼 A

Abstract To test the variation of different combined peroxidase（POD）during juice sac granulation in‘Hongroumiyou[Citrus grandis（L.）Osbeck. cv. Hongrou miyou]， and to investigate the influence of gibberellin（GA）on this process， the fruits of‘Hongroumiyousampled from normal and GA-treated plants were used as the models in this study， which were taken to calculate granulation index， and their juice sac near and away from the vascular cylinder were sampled to determine POD extraction and enzyme activity. The results showed that， the juice sac granulation index of‘Hongroumiyoushowed a rise. The treatment of GA did not significantly influence such variation pattern. pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl and pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl containing 0.1% Triton X-100 and 1 mol/L NaCl were established as the optimal extraction buffer for soluble and ion-bound POD， respectively. But， the covalently-bound POD was not extracted. The whole activities of soluble and ion-bound POD were both falling during growth and development process. The soluble POD activities between juice sacs close to the stele and away from the stele had significant difference（p<0.01）in normal and GA-treated fruits， and which between normal to GA-treated fruits also had significant difference（p<0.01）in juice sacs close to the stele and away from the stele， while the ion-bound POD activities had significant difference（p<0.01）in away from the stele. Therefore， soluble POD was significantly related to the process of juice sac granulation， However， the influence of ion-bound POD， covalently-bound POD and GA on juice sac granulation requires further investigation.

Key words ‘Hongroumiyoupummelo； Granulation； Activity of POD； Gibberellin

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.008

柚[Citrus maxima （Burm.） Merr.]是我國最重要的經濟果樹之一，因其果實碩大，果肉香甜且富含對人體有益的維生素C、黃酮等成分而享譽世界[1]。但發生在果實發育和采后貯藏階段的汁胞粒化現象（見圖1）對其食用品質和商品價值造成了嚴重影響[2]。因此，柚汁胞粒化問題的研究對于柚產業的可持續發展具有重大意義。

目前關于柚生長發育過程中所發生的汁胞粒化現象，佘文琴[3]已從形態解剖學、生物學特性、生理生化和分子生物學角度進行了研究，但還未能闡明粒化的產生機制。本課題組的前期研究中發現木質素代謝與柚汁胞粒化密切相關，POD是木質素形成過程中的一個關鍵酶，能催化木質素前體發生氧化聚合反應形成復雜的木質素聚合物[4]。而且柚汁胞中木質素積累與活性氧（H2O2）含量的顯著增加有關[5]，POD又是活性氧代謝中重要的活性氧清除酶之一。由此可見，POD與汁胞粒化的發生關系密切，且植物體內的POD主要以可溶態、離子結合態、共價結合態3種形式存在[6]，因此本研究從木質素代謝途徑入手，以粒化較為嚴重的‘紅肉蜜柚汁胞為實驗材料，對參與木質素前體氧化的3種不同形態POD建立最優提取體系并對果實發育過程中POD酶活進行相關分析，以期找出其與粒化的相關性。此外，還有研究表明，在柚果實膨大時期進行赤霉素噴灑會加速果實粒化進程[7]。為此，本研究對部分試驗果樹噴布赤霉素作為對比，統計其粒化指數的變化并觀察其對不同形態POD活性的影響，以期為后續汁胞粒化機制的研究提供更多有用的信息，從而解決生產上柚果實汁胞粒化的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘紅肉蜜柚果實來源于福建漳州平和縣，果實采摘于盛花期后95～211 d，這其間，對部分‘紅肉蜜柚樹于127 d進行50 mg/L赤霉素處理。每個時期的樣品具備3個生物重復，每個生物重復由3個不同生長部位的果實混果而成。參照佘文琴[3]的方法進行粒化指數觀測記錄（見圖2）后，將各果實靠近中柱（近中柱）和靠近海綿層（遠中柱）的汁胞分別取下，用液氮處理后存放在超低溫冰箱中（-80 ℃）備用。

1.1.2 試劑與設備 Tris（分析純）、Triton X-100（優級純）、30% H2O2（優級純）、NaCl（優級純）、NaH2PO4（優級純）、Na2HPO4（優級純）、赤霉素（Gibberellic acid mix，生工，優級純）、濃鹽酸（分析純）、愈創木酚（優級純）、雙蒸水（ddH2O）、石英砂等。

渦旋儀（MX-S）、恒溫搖床（ZWY-240）、恒溫循環水浴裝置（HH-501）、紫外可見分光光度計（TU-1901）、臺式高速冷凍離心機（Allegra X-22）、小型研缽、10 mL離心管、移液槍等。

1.2 方法

1.2.1 可溶性POD提取體系篩選 取1 g左右的汁胞樣品，按表1 A～L 12種緩沖液組合（緩沖液事先于冰上預冷）于冰上小型研缽中加入少量石英砂進行研磨，固液比為1 ∶ 4（先用2 mL進行研磨，再用1 mL洗滌2次）。研磨結束后將樣品徹底轉移到10 mL離心管中，徹底渦旋，4 ℃、15 000 ×g離心10 min，取上清進行酶活測定并記錄上清總體積。每個組合重復4次，全程在4 ℃條件下進行。

1.2.2 離子結合POD提取體系篩選 用上述篩選出的最優可溶性POD提取緩沖液（pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液）按上述方法提取可溶性POD，并將沉淀物中的可溶性POD洗至沒有活性后，加入分別含0.1% Triton X-100、1 mol/L NaCl、 （0.1%

Triton X-100+1 mol/L NaCl）、 （0.1% Triton X-100+

10% glycerin）、（1 mol/L NaCl+10% glycerin）、（0.1%

Triton X-100+1 mol/L NaCl+10% glycerin）、 （0.1%

Tweens+1 mol/L NaCl）、（0.1% CTAB+1 mol/L NaCl）的pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液。參照王蓓[8]的方法，進行徹底渦旋，于16 ℃恒溫搖床中280 r/min振蕩1 h，4 ℃、15 000 ×g離心10 min，取上清進行酶活測定并記錄上清總體積。每個組合重復4次，全程在4 ℃條件下進行。

1.2.3 共價結合POD活性測定 用上述優化的最佳緩沖液提取離子結合POD后，將沉淀物中的離子結合POD洗至沒有活性，再用pH5.5，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗滌3次。參考García-Gómez等[9]的方法，加入含0.5%（p/v）纖維素酶、2.5%（p/v）果膠酶的pH5.5，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液4 mL，于20 ℃恒溫搖床中300 r/min振蕩5 h，4 ℃、15 000 ×g離心10 min，取上清進行酶活測定并記錄上清總體積。每份樣品重復4次。

1.2.4 汁胞各發育時期POD酶活測定 參考Venkatachalam等[10]的方法，用上述優化后的最佳緩沖液提取汁胞各發育時期不同部位的POD后，按表2的體系組分配比于25 ℃、470 nm測定并記錄1 min內的吸光值變化。單位鮮重的樣品每分鐘變化0.01個吸光值定義為一個酶活力單位，即：

1 U=ΔA470/（g FW·min）

1.3 數據處理

數據使用SPSS 19.0軟件及Excel 2010進行分析。

2 結果與分析

2.1 可溶性POD提取體系篩選

提取緩沖液的組分、濃度及pH值對所提取的可溶性POD酶活力有一定的影響，為獲得具有較高酶活力的‘紅肉蜜柚可溶性POD，以便于后期研究，本試驗對可溶性POD提取體系進行初步篩選。由圖3可以看出，在所測試的3個因素的組合中，pH8.0， 0.1 mol/L Tris-HCl提取體系獲得的可溶性POD活性最高，因此，將該提取體系用于‘紅肉蜜柚汁胞可溶性POD的提取。

2.2 離子結合POD提取體系篩選

關于柚汁胞中的離子結合POD尚未有研究報道，為獲得具有較高酶活力的離子結合POD，以便對其進行后續研究，本試驗對離子結合POD提取體系進行初步的篩選。由圖4可知，緩沖液中不同添加劑對離子結合POD的提取效果差異很大。0.1% Triton和1 mol/L NaCl單獨添加或在單獨添加的基礎上均添加10%甘油提取效果都較差，而0.1% Triton和1 mol/L NaCl一起使用則提取效果顯著提高，但其添加10%甘油后則效果不佳，此外，將去垢劑Triton換成Tweens或CTAB后，提取效果均不如Triton。因此，本試驗選用添加0.1% Triton和1 mol/L NaCl的pH8.0，0.1 mol/L Tris-HCl作為柚汁胞離子結合POD的提取體系。

2.3 共價結合POD活性測定

關于柚汁胞中共價結合POD的研究也未見報道。在預試驗中分別取盛花期后107、137、170和191 d的樣品進行共價結合POD活性測定，結果均未能檢測，可能柚汁胞中確實不存在共價結合POD，或因0.1% Triton+1 mol/L NaCl提取過程較劇烈，導致共價結合POD失活。

2.4 汁胞各生長發育時期POD活性測定

由圖5可知，未經赤霉素處理與經赤霉素處理的可溶性POD活性在生長發育過程中整體均呈下降趨勢，且經赤霉素處理后的近中柱、遠中柱汁胞可溶性POD活性均比未經赤霉素處理的低。通過配對樣本T檢驗發現，未經赤霉素處理的近中柱與遠中柱汁胞的可溶性POD活性存在極顯著差異（p<0.01），經赤霉素處理后的近中柱與遠中柱汁胞的可溶性POD活性也存在極顯著差異（p<0.01）；且有無赤霉素處理的近中柱汁胞可溶性POD活性存在極顯著差異（p<0.01），有無赤霉素處理的遠中柱汁胞可溶性POD活性也存在極顯著差異（p<0.01）。

如圖6所示，未經赤霉素處理與經赤霉素處理的離子結合POD活性在生長發育過程中整體亦呈下降趨勢，同可溶性POD相比，活性較低，與其存在極顯著差異（p<0.01）。配對樣本T檢驗顯示，未經赤霉素處理的近中柱與遠中柱汁胞的離子結合POD活性無顯著差異（p>0.05），經赤霉素處理后的近中柱與遠中柱汁胞的離子結合POD活性也無顯著差異（p>0.05）；且有無赤霉素處理的近中柱汁胞離子結合POD活性同樣無顯著性差異（p>0.05），但是，有無赤霉素處理的遠中柱汁胞離子結合POD活性卻有極顯著性差異（p<0.01）。

3 討論

從研究結果可以看出，根據結合形態，‘紅肉蜜柚果實汁胞中POD主要以可溶性和離子結合狀態存在，在生長發育過程中，伴隨粒化指數的升高，汁胞中的可溶性POD活性整體呈下降趨勢，與佘文琴[3]的研究相一致。近中柱與遠中柱可溶性POD活性的極顯著差異表明POD可能與汁胞粒化密切相關，而赤霉素的處理使可溶性POD活性與未處理的也出現了極顯著的差異，說明赤霉素可能對汁胞粒化有一定的影響。但是，赤霉素處理后近中柱與遠中柱汁胞的可溶性POD活性均降低，且從汁胞粒化指數的最終結果來看，赤霉素處理與未經處理的相比，其粒化指數較低但是并無顯著性差異，其粒化的進程也并未提前或者變快。這一結果與前人的研究結果[11]并不一致，可能是由于對試驗果樹果實赤霉素噴布的次數過少和噴布時的天氣過于炎熱，導致果面水分迅速蒸發使得溶解其中的赤霉素未能充分地運輸到果實內部有關。因此，赤霉素處理對粒化的具體作用有待進一步研究。

此外，木質素代謝的相關研究還表明，木質素的氧化反應及聚合過程均發生于細胞壁上[4，12]，所以細胞壁上的離子結合態POD可能和粒化的關系更為密切，但目前關于粒化過程中的離子結合態POD卻未見研究報道。可是，從本試驗離子結合POD的酶活結果可知，其變化上并未顯示出與粒化的相關性，且其酶活性較可溶性POD低很多，近、遠中柱也未表現出顯著性差異，只是遠中柱赤霉素處理與未處理的酶活有極顯著差異，這可能與遠中柱較靠近果實外圍受赤霉素影響較大有關。但是，粒化時期，POD同工酶譜實驗中，卻發現離子結合POD出現了5個特異性堿性POD組分，可能與汁胞粒化關系密切（待發表）。所以，POD在粒化過程中所扮演的具體角色仍有待進一步研究。

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