不同發酵方式對海南粗榧內生真菌CH1307c合成次級代謝產物的影響

林淑婷　李從發　胡曉蘋　劉翊昊　徐傳標　李培　周偏　劉四新

摘 要 為研究不同發酵方式對內生真菌次級代謝產物產量、成分類別及其對3種常見白血病細胞株的細胞毒活性影響。分別采用大米固態發酵、麥麩固態發酵、馬鈴薯液態靜置發酵、馬鈴薯動態發酵4種發酵方式對分離自海南粗榧韌皮部內生真菌CH1307c進行發酵，并采用乙酸乙酯進行萃取，通過試管定性試驗和MTT試驗測定其粗提物的成分類別及其對細胞株K562、NB4、HL60的細胞毒活性。結果表明：大米固態發酵、麥麩固態發酵的次級代謝粗提物產量相對于馬鈴薯動態發酵分別增加了45.9倍和28倍；馬鈴薯動態發酵較其靜置發酵產量高9.1倍。試管定性試驗結果表明，大米固態發酵獲得的粗提物，化合物種類最多，麥麩發酵和動態發酵次之，馬鈴薯液態靜置發酵最少。此外，4種發酵方式獲得的代謝粗提物對3株細胞株的抗腫瘤活性（IC50值）并未呈現明顯差異。研究結果為該菌株的大規模發酵提供理論依據。

關鍵詞 海南粗榧；發酵方式；內生真菌；化學成分；抗癌活性

中圖分類號 R284 文獻標識碼 A

Abstract The effect of the different fermentation methods for the endophytic fungus on the yield of secondary metabolites component categories and the cytotoxic activities against the three common leukemia cell lines was investigated. The methods of rice solid-state fermentation， wheat bran solid-state fermentation， potato liquid-standing and potato dynamic fermentation were carried out for CH1307c， which was isolated from phloem of Cephalotaxus hainanensis Li， and culture media were extracted with ethyl acetate. The categories of the crude extractions and their cytotoxic activities against cells K562， NB4 and HL60 were determined by using in vitro qualitative test and MTT test. Compared to the potato dynamic fermentation， the yields of secondary metabolites by rice and bran solid-state fermentation were increased by 45.9 and 28 times， respectively. In addition， the yield of potato dynamic fermentation was higher than its static way with 9.1 times. The results of in vitro qualitative test showed that component species of crude extraction by rice solid-state fermentation was richest， those by wheat bran solid-state and potato dynamic fermentation were second， and that by potato standing fermentation was fewest. Furthermore， the antitumor activities of secondary metabolites of the crude extractions by four fermentation ways towards the three cell lines（concentration of IC50 value）did not exhibit obvious difference. This study provide a theoretical basis to the large-scale fermentation of the strain.

Key words Cephalotaxus hainanensis Li； Fermentation； Endophytic fungi； Chemical composition； Antitumor activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.026

植物內生真菌（endophyte）是指可在健康植物組織內部穩定生活而不引起宿主病變的一類真菌[1]。從其次級代謝產物中分離得到的化合物大多具有抗菌、抗腫瘤、免疫調節等活性[2-7]。而菌株產生次級代謝產物的能力，除了受合成該產物的基因種類和數量的制約外，與培養條件也密切相關[8]。同時研究證實，通過改變菌株的生長微環境（如培養基質、營養成分、濕度等）可激活菌株的“沉默代謝途徑”，增加菌株次級代謝產物的多樣性，從而提高菌種資源的利用率[9]。

OSMAC（one strain-many compounds）策略是提高菌株次級代謝產物產量和類別的有效手段[10-12]。Bode等[13]采用該法從6株微生物中獲得了25類100余個化合物。謝綿測等[14]僅將煙曲霉培養基由酵母膏蛋白胨葡萄糖改變為麥芽瓊脂，所獲得的主要化合物便從1個提高到7個。液態發酵和固態發酵是微生物常用的2種發酵方式，不同的培養基質與培養方式對微生物代謝產物的產量以及類型都影響較大，楊寧[8]發現研究的35株放線菌在固態培養基質下共產生34種次級代謝產物，是液態發酵的2倍。Priyani等[15]發現Chaetomium chiwersii在同種培養基的液態培養中主要產生chaetochromin A，而在固態培養中則主要產生radicicol。因此，在研究內生真菌的次級代謝產物時，必須考慮不同的培養環境對菌株次級代謝產物合成水平的影響。

目前對內生真菌培養方式的研究，普遍做法是選用一種基礎培養基，通過對其發酵條件（如接種量、發酵時間、溫度、pH、添加劑等）進行探究，從而達到優化目的[16-17]。而菌株發酵時固態發酵常以靜置方式、液態發酵則以靜置及動態方式，但內生真菌在不同基質以及不同培養方式中其次級代謝產物合成水平的研究較少。同時本實驗室前期研究發現，動態發酵合成的次級代謝產物總量少且種類有限[18-19]，且對某些內生真菌的發酵條件進行優化后，其發酵產物的增加不顯著[20]。考慮到內生真菌原位生態環境供氧并不豐富的特點以及動態發酵應用的局限性，本研究擬選用實驗室常用的幾種真菌培養基對實驗室保藏的一株絲狀真菌進行發酵，通過對其次級代謝粗提物的總產量、所合成化合物的類別及其抗腫瘤細胞活性等幾個方面進行效果評價，以尋求更合適的菌株發酵方式，為后續的進一步分離純化、尋找關鍵活性物質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種與標準品 內生真菌細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）CH1307c，由本實驗室分離自海南粗榧韌皮部。高三尖杉酯堿標準品（HHT），購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 癌細胞株 細胞K562（人慢性髓原白血病細胞），細胞NB4（急性早幼粒白血病細胞）購于中國典型培養物保藏中心；細胞HL60（人急性髓原白血病細胞）購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.1.3 試劑 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培養基購自北京索萊寶，細胞實驗級；Iscoves modified Dulbecco medium（IMDM）培養基購自Gibco，細胞實驗級；胎牛血清購自Hyclone，細胞實驗級；3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide（MTT）購自Amresco，分析純；乙酸乙酯、氯仿、二甲基亞砜、無水硫酸鈉等均購自廣州化學試劑廠，分析純。

1.1.4 儀器與設備 電子精密天平PB303-N型，梅特勒-托利多儀；立式旋轉蒸發儀RE-5203AA型，上海亞榮儀器設備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋YXQ SG41.280型，上海醫用核子儀器廠；循環真空泵SHZ-D（III）型，上海隆拓儀器設備有限公司；超凈工作臺CSY-2型，上海凈化設備廠；全自動酶標儀SynergyHT型，Bio-Tek；倒置顯微鏡CKX41SF型，OLYMPUS；全自動細胞計數器TC10型，bio-Red；雙人單面超凈工作臺SW-CJ-2FD型，蘇潔凈化；CO2培養箱MCO-175型，SANYO；臺式低速離心機TD5M型，長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.1.5 培養基 種子培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自來水1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

大米培養基：大米50 g、自來水25 mL于250 mL三角瓶，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

麥麩培養基：麥麩20 g、自來水35 mL于250 mL三角瓶，自然pH，121 ℃滅菌20 min，趁熱搖散[21]。

馬鈴薯培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自來水1 000 mL，裝液量100 mL于250 mL三角瓶，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

細胞培養基：含10%胎牛血清的RPMI1640培養基；含20%胎牛血清的IMDM培養基。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 種子液制備：取經活化的CH1307c斜面菌絲一環至種子培養液中，于28 ℃ 115 r/min的搖床中培養至培養液中清晰可見密集菌絲球，備用。

大米固態發酵：取滅菌的大米培養基9瓶，每瓶接種2 mL的種子液，靜置發酵30 d。

麥麩固態發酵：取滅菌的麥麩培養基9瓶，每瓶接種2 mL的種子液，靜置發酵30 d。

馬鈴薯液態靜置發酵：取滅菌的馬鈴薯培養基9瓶，取種子液以2%（V/V）的接種量接種，靜置發酵30 d。

馬鈴薯動態發酵：取滅菌的馬鈴薯培養基9瓶，取種子液以2%（V/V）的接種量接種，于28 ℃ 115 r/min的搖床中培養至發酵液中布滿菌絲球。

將以上4種發酵方式各設置3組平行試驗，取不接種的各培養基進行空白對照試驗。

1.2.2 發酵產物的提取 固態發酵培養物用乙酸乙酯以浸沒分次萃取4次，液態發酵培養物用乙酸乙酯以1 ∶ 1分次萃取4次，靜置萃取間隔12 h，合并4次有機萃取相，于40 ℃減壓濃縮得浸膏，備用。

1.2.3 化學成分類別測定 將各待測樣品制備后，采用試管法對各樣品進行化學成分分析，根據各特定的顏色、沉淀等反應特征，判斷該樣品中可能含有的化合物類別[22]。

1.2.4 抗癌活性測定 準確稱取標準品HHT以及4種發酵方式獲得的次級代謝粗提物，用含DMSO（1%；V/V）的PBS溶液配制成系列濃度（1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL），備用。分別取對數生長期的各細胞株，將細胞K562、NB4用RPMI1640培養基分別配制成濃度4×104個/mL、6×104個/mL的細胞懸浮液，將細胞HL60用IMDM培養基配置成濃度1×105個/mL的細胞懸浮液；以每孔90 μL加至96孔培養板，于37 ℃的CO2（5%）培養箱中培養過夜；以每孔10 μL加入系列濃度的發酵提取液浸膏以及標準品HHT；繼續培養2 d后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL；繼續培養4 h后，加入三聯液100 μL；過夜，于570 nm的波長下測定每孔吸光值；每板需設多個復孔的陽性對照以及陰性對照，每個濃度設置3個重復。按下式計算抑制率。并計算IC50值[23]。

抑制率（IR）=（1-待測樣品OD570值/陰性對照OD570值）×100%

1.3 數據處理

采用SPSS 20軟件對所得數據進行統計分析，結果以平均值±標準差（Mean±Sd）表示。

2 結果與分析

2.1 不同發酵方式對內生真菌CH1307c次級代謝產物產量的影響

由表1可知，2種固態發酵：大米發酵及麥麩發酵所得粗提物產量分別為動態發酵的46.9倍及29.0倍，這可能是由于固態發酵更接近內生真菌生長的原生態，因此固態較液態的合成水平高。同時，對于該菌株大米較麥麩的產量高，說明該菌株在大米為基質的培養環境中合成水平較麥麩佳。使用液態發酵時，動態方式所得粗提物的產量為靜置方式的9.1倍，這可能是由于靜置發酵時菌絲只在培養液表面生長，無法充分利用營養物，而動態發酵雖然增加了溶氧量，但其菌體與培養基充分接觸，從而發酵效率提高。本實驗結果也表明，影響內生真菌次級代謝產物產量的因素包括供氧及菌株對培養基的利用率，且供氧的影響較大。

2.2 不同發酵方式對內生真菌CH1307c次級代謝產物化學成分類別的影響

由表2可知，對于固態發酵，大米發酵所得的粗提物7類檢測項目皆為陽性，化合物類別最為豐富，而麥麩發酵所得粗提物中未檢測到黃酮類化合物。對于液態發酵，動態方式所得粗提物除黃酮6項檢測項目皆為陽性，化合物類別較靜置方式更豐富，靜置方式只含酚類、生物堿類、甾體類以及油脂類化合物。

定性實驗雖無法準確判別該類化合物的存在與否，但未檢出的化合物類別即使存在含量也較低，而低含量的化合物較難分離，不利于后續研究。對比4種發酵方式發現，大米發酵最能激發菌株的“沉默代謝途徑”，提高菌株次級代謝產物的合成水平。因此，以化合物種類為指標，大米發酵最優。

2.3 不同發酵方式對內生真菌CH1307c次級代謝產物的抗癌活性影響

由表3的顯著性分析結果表明，4種發酵方式獲得的代謝粗提物對3種癌細胞的抑制增殖活性差異顯著，這可能是由于在同濃度下4種發酵方式獲得的粗提物在成分與類別上的差異，從而造成其抑制效果的不同。但據表4的IC50值可知，4種代謝粗提物對K562細胞的IC50值均大于100 μg/mL，即該菌株由4種發酵方式獲得的次級代謝產物對K562未表現出抑制增殖活性；4種代謝粗提物對細胞NB4、HL60的IC50值均在30～40 μg/mL且并無明顯差異，從IC50可知，由4種發酵方式獲得的該菌株的次級代謝產物對NB4、HL60細胞均具有較好的抑制增殖作用，推測是由于4種發酵方式獲得的代謝產物中，含有相同或相似的成分。實驗結果說明，該菌株由4種發酵方式得到的代謝粗提物含有抑制急性白血病細胞增殖的活性成分，具體機制有待進一步研究。

3 討論

本研究結果表明，4種發酵方式所獲得的菌株CH1307c的次級代謝產物對3株白血病細胞的IC50值無明顯差異，說明這4種發酵方式不影響該菌株次級代謝產物對3種白血病細胞的抑制增殖作用。但大米及麥麩固態發酵獲得的代謝產物，在產量及化合物類別上均顯著優于馬鈴薯液態發酵。而本實驗室前期通過對高活性的海南粗榧內生真菌F7進行動態發酵，60 L的發酵液只獲得了11.6 g的次級代謝產物浸膏[24]；陽暉蓉通過對海南粗榧內生真菌F127進行動態發酵，70 L的發酵液只獲得15.6 g的次級代謝產物浸膏[25]；本研究獲得的產量顯然極顯著地提高了內生真菌次級代謝產物的合成水平。這可能是由于液態發酵會抑制該菌株的生化代謝，不利于次級代謝產物的合成，而固態培養的微環境更接近于內生真菌生長的原生態，因此更有利于次級代謝產物的積累及化合物種類的多樣性[8]。同時，在工業生產中，液態發酵因所需設備體積大、費用高且易污染等因素限制了其的應用，然而固態發酵能克服上述不足。因此，固態發酵可作為提高該菌株次級代謝產物產量和多樣性的有效手段。

在本研究中，大米固態發酵獲得的次級代謝產物產量最高且化合物種類最豐富，因此，可選用大米固態發酵對該菌株進行大規模發酵，從而提高該菌株的菌種利用率。同時，本研究的結果也表明，選用合適的培養方式能顯著提高次級代謝產物的合成水平，該探索方法同樣也適用于其它內生真菌，這對提高內生真菌菌種資源的利用率有重要意義。另外，由于該菌株對NB4、HL60細胞表現出良好的抑制作用，今后將進一步對其抗癌活性的成分進行分離純化。

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