胡椒PnNPR1基因的克隆與表達分析

范睿　郝朝運　胡麗松　伍寶朵　鄔華松

摘 要 根據胡椒病程相關基因非表達子1（Nonexpressor of pathogenesis-related genes1， NPR1）基因的部分序列設計引物，運用RT-PCR方法獲得其家族成員的1個全長cDNA，命名為PnNPR1，長度1 712 bp，開放閱讀框1 362 bp，編碼454個氨基酸。預測 PnNPR1分子量為141.56 ku，理論等電點為4.98。該基因含有BTB/POT結構域、ANK錨蛋白重復序列、DUF和NPR1-like C等4個結構域，具有植物NPR1所共有的保守結構域。系統進化分析表明，PnNPR1與苜蓿的同源性最高。Real-time RT-PCR 結果表明，PnNPR1在胡椒葉片、根、莖和花中均表達，在葉中的表達量最高。辣椒疫霉菌誘導后，PnNPR1基因的表達量在抗/感2種胡椒中均出現先增加后減少的現象，并且在抗病種質中表達量較高。研究結果為PnNPR1的功能研究提供了理論依據。

關鍵詞 胡椒；病程相關基因非表達子1；克隆與表達

中圖分類號 S573 文獻標識碼 A

Abstract The full-length cDNA encoding Nonexpressor of pathogenesis-related genes1（NPR1）， designated as PnNPR1， was isolated from black pepper by using PCR. The sequence of PnNPR1 was 1 712 bp in length， containing a 1 362 bp open reading frame， and encoding a polypeptide of 454 amino acids with a calculated molecular weight of 114.56 ku and a pI of 4.98. The protein had four conserved domains of BTB/POT， ANK anchored protein repeat sequences， DUF and NPR1-like C. The phylogenetic analysis showed that PnNPR1 had a closer relationship with Medicago truncatala. Real time quantitative PCR analysis showed that the expressions of PnNPR1 were differentially expressed in the root， stem， leaf and flower of black pepper. When P. capsici infected， PnNPR1 was significantly higher in resistant germplasm than in susceptible germplasm， and all time point of expression of PnNPR1 were up-regulated by infected. This result would generate an important theoretical and practical significance for black pepper genetic improvements.

Key words Black pepper； Nonexpressor of pathogenesis-related genes1（NPR1）； Cloning and expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.013

胡椒（Piper nigrum）具有重要的藥用和工業價值，是世界最重要的香辛作物之一[1-3]。據FAO統計，世界胡椒收獲面積5.53×105 hm2，總產量達4.33×105 t，其中中國胡椒主要分布在海南、云南、廣東和廣西等地，年產量2.72×104 t，位居世界第五[4]。隨著胡椒新功能的不斷挖掘和人們飲食結構的變化，中國對胡椒的需求量還將大幅增加。目前中國主栽品種為熱引1號（P. nigrum c.v. Reyin-1），又稱印尼大葉種，中感胡椒瘟病，生產上仍采取預防為主、綜合防治為輔的措施，大大增加了種植生產成本[5]。胡椒主栽品種抗瘟病能力差已成為限制中國胡椒種植面積進一步擴大的重要因素，威脅著胡椒產業健康發展，因此選育適合中國氣候環境特點的高產、高抗新品種是產業發展的迫切需要。

轉基因育種可定向改良特定性狀，縮短育種周期，是培育作物新品種的重要手段。長期以來，傳統的作物育種技術為雜交、誘變育種，但存在育種周期長、選擇準確性差、育種效率低等缺點，特別是應用于多年生木本植物時更加明顯。轉基因技術既可在受體中表達受體的同源基因，也能打破物種限制，在受體中表達來自于不同受體的外源基因，從而達到定向改良某一或某些性狀的目的[6]。病程相關基因非表達子1（Nonexpressor of pathogenesis-related genes1， NPR1）是植物抗病信號傳導途徑的關鍵調控基因。NPR1基因是植物抗病信號傳導途徑一個關鍵的調控基因，激發植物防御機制產生系統獲得性抗性，增加防御反應強度和速度，使植物具有廣譜抗病性[7]。近年來，國內外科學家較為系統地研究了NPR1基因包括NPR1基因的結構、作用機理、在植物抗病中的作用，預測在抗病育種中的應用前景等。自1994年首次從擬南芥分離得到NPR1基因，并陸續轉入到不同類型作物中。2001年，Park等[8]將擬南芥NPR1基因超表達載體導入到水稻中發現轉基因植株對細菌性枯葉病原體（X00）的抗性提高了，通過RNA點雜交發現轉基因植株抗病性的提高是因為NPR1基因的高表達，首次證明了NPR1基因可以提高單子葉植物抗病性。同樣，在一些重要的經濟作物中如煙草、油菜、西紅柿、甘藍、椰菜、馬鈴薯、玉米、小麥發現同源基因，并且其調控機制基本一致[9-10]。大量研究表明，轉NPR1基因可提高轉基因作物對部分真菌和細菌的抗性，具有巨大的潛在應用價值。但是，目前還沒有關于NPR1基因在胡椒中的克隆與表達研究。

本研究擬通過RT-PCR法從胡椒中克隆NPR1抗病關鍵基因，分析其表達模式，為今后胡椒遺傳改良、轉基因育種等提供重要依據，具有重要的理論及現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及處理 試驗材料熱引1號胡椒來自胡椒標準化種植示范園，為中國主栽品種，中感胡椒瘟病；黃花胡椒（Piper flaviflorum）來自農業部胡椒種質資源圃，為栽培種的野生近緣種，中國特有物種，主要分布在云南東南和西南部，高抗胡椒瘟病。切取健壯無病蟲害的當年生主蔓，修剪成長度約40～60 cm、具4～7節和6～12片葉的扦插苗，采用沙培法植于溫室中，待生根后進行針刺接種。將辣椒疫霉菌孢子用無菌水稀釋至每毫升約5×106個，用于針刺接種。抗/感種質材料種苗均分為2組，按照如下方式進行：一組材料作為接種組，每個苗針刺3次；另一組作為對照組，用無菌水替代病原孢子液，同方法針刺接種。針刺處理在30 min內完成。根據Panstruga等[11]研究，接種后48 h 內是病菌孢子萌發、侵染以及植物體內受體識別侵染信號并做出反應的關鍵時期，因此接種組取樣時間為未處理即0 h，以及處理后的8，12和24 h，分別取接近主蔓的根部組織用于后續試驗。取樣后立即投入液氮中，并迅速轉移至實驗室-80 ℃保存備用。

1.1.2 試劑及核酸測序 RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自Axygen公司，逆轉錄酶、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α菌株購自TaKaRa公司，SYBR Green qRT-PCR試劑盒購自伯樂有限公司，核酸測序和引物合成委托上海英駿生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 參照試劑盒方法提取總RNA。取2 μg RNA樣品根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.2 胡椒NPR1基因的克隆 搜索胡椒EST數據庫（SRS856941），根據CL4128.Contig2_F0463-PN序列設計引物CL4128-F-S和CL4128-F-A（表1），以胡椒根部組織cDNA為模板進行PCR擴增，程序為：94 ℃預變性4 min，30個循環（94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min）72 ℃延伸7 min。PCR 產物（基因片段A）回收后連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆測序。

1.2.3 胡椒PnNPR1序列的生物信息學分析 利用NCBI網站中的BlastX對序列進行比對，系統進化分析選取同源性>30%的序列進行。蛋白理化性質分析利用Protparam在線分析軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）進行，用Prosite數據庫分析氨基酸序列的功能域，預測蛋白是否存在信號肽和亞細胞定位使用PredictProtein工具（https：//www.predictprotein.org/），用SPORT軟件（http：//psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl）進行亞細胞定位分析，用PHD工具分析蛋白二級結構，利用DNAman軟件構建同源性和系統進化樹。

1.2.4 PnNPR1定量PCR分析 以PnHistone3基因為內參對照，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ進行定量PCR分析，引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環。每個樣品進行3次重復，所有的樣品數據分析，相關基因的表達使用2-△△CT方法定量，結果為平均值±SD。統計學分析采用SPSS20.0統計分析軟件進行數據處理，定量比較采用t檢驗方法，以p<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 PnNPR1基因cDNA序列的克隆

基于已獲得的胡椒EST序列片段，在目的基因的5′端和3′端設計引物擴增出目的基因，獲取2 kb左右片段。去除載體序列，該基因全長1 712 bp，包含一個1 362 bp的完整開放閱讀框，編碼454個氨基酸殘基的蛋白質，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，5′端非編碼區326 bp，3′端非編碼區32 bp，推測的氨基酸與核酸序列見圖1。

2.2 生物信息學分析

PnNPR1蛋白的分子式為C5 212H8 714N1 712O2 198S344，編碼454個氨基酸殘基，相對分子質量為141.56 ku，等電點為4.98，理論推導半衰期大于10 h，屬于不穩定蛋白。該蛋白中相對含量比較多的氨基酸是Thr（485個，28.3%）、Ala（474個，27.7%）、Gly（409個，23.9%）、Cys（344個，20.1%），Pyl和Sec的含量為0。總的帶負電荷的殘基（Asp+Glu）和正電荷的殘基（Arg+Lys）均為0，親水性平均數為0.707，預測該蛋白為水不溶性蛋白。根據SPORT軟件分析結果，預測該基因主要分布在細胞核（47.8%）和細胞質（34.8%）中，無信號肽。NCBI對其保守結構域進行分析表明，該基因含有ANK錨蛋白重復序列、BTB/POT結構域、DUF和NPR1-like C等4個結構域（圖2）。

蛋白質多肽鏈通常折疊和盤曲成比較穩定的空間結構，蛋白質的空間結構與其特定生物學功能密切相關。常見的二級結構有α-螺旋（α-helix）、β-折疊（β-pleated sheet）、β-轉角（β-turn）、無規則卷曲（Random coil）、延伸鏈（extend strand）等。PHD軟件分析表明，PnNPR1主要由α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈構成，3種結構所占比例分別是60.49%，25.17%和7.73%（圖3），可見α-螺旋是PnNPR1最主要的二級結構。

從NCBI網站上獲取其他作物的NPR1氨基酸序列，將PnNPR1氨基酸序列與其它植物的NPR1比較，發現PnNPR1與苜蓿（Medicago truncatula）、葡萄（Vitis vinifera）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）等作物的NPR1家族成員的同源性分別達到63.4%，46.4%，46.2%和46%（圖4）。構建的進化樹表明，PnNPR1最先與苜蓿NPR1聚合；與番茄、葡萄、楊樹、大豆序列進化距離均較遠，推測這種現象可能與物種起源地有關，同時胡椒是基部被子植物中最大的屬之一，屬于傳統的木蘭亞綱（圖5）。

2.3 PnNPR1的表達模式分析

以histone3為內參，用real-time PCR方法分析PnNPR1表達模式。結果顯示，PnNPR1在熱引1號胡椒不同組織中均有表達，表達水平從高到低依次為葉、莖、根、花（圖6）。

以病原菌侵染后不同時間點的根部cDNA為模板進行qPCR分析來研究PnNPR1基因的表達特征，結果表明：在處理前，黃花胡椒與熱引1號胡椒的PnNPR1表達量均較低，辣椒疫霉菌誘導后，PnNPR1基因的表達量在2種種質中都明顯增加，隨著處理時間的延長，該基因呈現出先增加后降低的變化趨勢；處理后12 h表達量達到最大，隨后開始下降，并且，所有處理時間下，黃花胡椒的表達量均大于熱引1號胡椒（圖7）。

3 討論與結論

項目組前期研究中獲得了一個與NPR家族蛋白具有高度同源性的EST特異序列[12]，根據此序列從胡椒中克隆得到一個NPR1基因，將其命名為PnNPR1。對該基因進行生物學信息分析，預測該蛋白為水不溶性蛋白，主要分布在細胞核和細胞質中，研究表明NPR1功能發揮非常必要的條件就是核定位特性[13]，NPR1蛋白在非誘導狀態下通常以多聚體形式存在于細胞質內，一旦發生SAR誘導，NPR1蛋白氧化為單體并轉移到核內，與多種TGA轉錄因子相互作用并激活PR基因表達，最后導致植物產生免疫反應[14]。PnNPR1基因同時具有植物NPR1所共有的保守結構域，其中BTB/POT結構域、ANK錨蛋白重復序列這2個結構域對NPR1基因發揮其功能極為重要，同時涉及蛋白質與蛋白質之間的相互作用，前期對這些區域高保守的氨基酸進行點突變的結果驗證了這一說法[15-17]。另有研究表明NPR1基因與TGA轉錄因子結合的必要元件是ANK結構域，正向調控PR基因表達，使植物產生SAR[18]，推測NPR1可能通過與其它蛋白的相互作用參與調節植物防衛反應。

本研究中，接種辣椒疫霉菌后不同時間下，PnNPR1基因在根、莖、葉和花中均有表達，且表達存在明顯差異，其中葉片中的表達量最高，花的表達豐度最低。這與荊州黑麥ScNPR1基因的表達相似，均在葉中表達量較高，而擬南芥AtNPR1基因、水稻OsNPR1基因均無組織特異性表達，推測NPR1組織特異性表達可能與不同物種有關。

NPR1是SAR的一個中心元件，表達在PR基因之前，但在SA積累之后阻止SAR信號的發生[19]。NPR1基因在正常植株中有少量表達，當用SA或INA處理[20]或病原菌侵染時[21]，其表達量可提高大約2～4倍，本研究發現胡椒PnNPR1基因在辣椒疫霉菌侵染下表達量都升高，且不同時間段其表達差異顯著，在12 h下到達最高值，產生這一現象可能是因為PnNPR1的轉錄受到病原菌的反饋機制調節，使蛋白維持在一定的水平，進一步說明了PnNPR1基因調控胡椒瘟病及信號傳導中的重要作用。研究同時顯示，將從水稻中克隆的OSNPR1基因在水稻中高表達，能夠提高該作物對白葉枯病和稻瘟病的抗性[22]；從抗黃枯萎病海島棉克隆獲得GbNPR1基因，將其轉入到煙草中，可顯著提高轉基因煙草對赤星病菌的抗性，且其轉錄水平受棉花黃萎病原菌誘導[23]。另外，本研究發現，胡椒抗病種質（黃花胡椒）與感病種質（熱引1號胡椒）受辣椒疫霉菌侵染后表達存在差異，不同時間段抗病種質的表達量都略高于感病種質，這說明不同抗性水平的胡椒種質PnNPR1基因的表達模式也存在一定的差異，這與橡膠樹HbNPR1基因的表達結果相近[24]。抗病種質PnNPR1基因表達增強，有助于激活下游防衛基因的表達，從而產生系統獲得抗性。本研究中胡椒PnNPR1基因的獲得及其表達模式為開展PnNPR1功能與分子機制的研究及培育胡椒新品種奠定基礎。

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