茶樹EGCG合成過程相關的Ankyrin基因的克隆與表達分析

鄭世仲　林玉玲　孫平　賴鐘雄　林金科

摘 要 運用RACE技術，從茶樹新品系“1005”嫩芽中克隆出Ankyrin基因全長cDNA（2 034 bp），5′UTR和3′UTR分別為353 bp和55 bp，編碼541個氨基酸，命名為CS-Ankyrin。基因全長序列在線blast比對分析結果表明，該基因與葡萄、蓖麻、可可和楊樹的Ankyrin序列的一致性分別為78%、78%、77%和77%。生物信息學分析顯示，CS-Ankyrin錨蛋白重復序列是由5個ANK單元組成，該蛋白是定位在質膜上起作用的跨膜疏水蛋白，但疏水性較差；系統進化樹分析表明，該基因編碼的氨基酸與芝麻的親緣關系最為接近。比較CS-Ankyrin在不同發育階段葉片的表達和EGCG含量變化結果表明，CS-Ankyrin基因在3個品系不同樣品的表達趨勢與其EGCG含量變化趨勢一致，芽頭>二葉>四葉；亞細胞定位試驗結果表明，CS-Ankyrin蛋白定位在細胞膜上起作用。推測該蛋白可能參與EGCG的儲存和跨膜運輸。

關鍵詞 茶樹；錨蛋白重復序列；生物信息學；EGCG；亞細胞定位

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A

Abstract The full-length cDNA（2 034 bp） of one Ankyrin gene named CS-Ankyrin was cloned from the Camellia sinensis“1005”using RACE technique， which encoding a 541 amino acid protein. Bioinformatics analysis showed that， with low hydrophobicity， the encoded protein consisting of 5 ANK was hydrophobic and functioned in plasma membrane. Phylogenenetic analysis showed that the protein encoded by CS-Ankyrin had the closest genetic relationship with that in Sesamum indicum. Comparing the expression level of CS-Ankyrin and the EGCG content at different developmental stages of three cultivars， CS-Ankyrin expression was observed to vary with a similar trend observed for each cultivar： bud>the second leaf>the fourth leaf. The changes in EGCG was also found to follow a similar trend to that for gene expression. The subcellular localization results showed that the protein was located in the cytomembrane. We speculate that the protein is related to storage and transmembrane transport of EGCG.

Key words Camellia sinensis；Ankyrin repeat；Bioinformatics；EGCG；Subcellular localization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.015

EGCG（Epigallocatechin gallate）是茶葉品質的關鍵核心成分之一，也是茶多酚中最有效的活性成分，為類黃酮化合物，具有很強的抗氧化、抗癌、抗輻射、抗糖尿病、抗高血脂等功效[1-4]。因此，EGCG在食品加工、醫藥、化工等領域具有廣闊的應用前景。EGCG可以作為食品添加劑或者開發為功能性食品，有研究也表明，EGCG在食品體系中也可以發揮很強的抗氧化效果，抗氧化能力比VE還強[5]。喝茶，特別是高EGCG茶對于提高肌體免疫能力、抗衰老、抗癌、降血脂、預防糖尿病等都具有很好的保健作用[2，6-9]，不同茶樹品種發育程度不同的茶樹新梢芽葉，EGCG的含量不盡相同，雖然有關類黃酮化合物生物合成的基本途徑已經探明[10-11]，相關產物的組分變化也有相關報道[12]，但EGCG生物合成的分子機制仍然比較模糊。茶樹類黃酮化合物生物合成的一些結構基因已經被分離鑒定，如PAL（Phenylalanine Ammonialyase）、 ANR（Anthocvanidin Reductase）、 ANS（Anthocyanidin Synthase）、 DFR（Dihydro Flavonol 4-reducta）、 CHS（Chalcone Synthase）、 CHI（Chalcone Isomerase）、 F3H（Flavanone 3-hydroxylas）、 LAR（Leucoanthocyanidin Reductase）等[13-15]，但決定茶樹EGCG生物合成的關鍵基因還未完全明確。

1987年，Breeden和Nasmyth在2個酵母細胞周期調控蛋白中發現了錨蛋白重復（ankyrin repeat，ANK）序列模體。錨蛋白重復序列普遍存在于真核、原核及病毒中，主要功能是介導蛋白質間的相互作用[16-17]。各個ANK蛋白中ANK的數目、一級序列及其空間結構上均有差異，因此ANK模體能夠和不同的蛋白質配體結合，從而實現功能的多樣化，包括形成細胞骨架的完整性、參與植物自身的防疫、生物體的生長發育、物質的合成與運輸。目前，關于錨蛋白重復序列的研究主要集中在動物體，植物錨蛋白的研究相對較少，只在擬南芥、煙草和水稻等模式植物中有報道[18]，茶樹中有關錨蛋白重復序列的研究還未見報道。

本課題組經過前期的實驗研究，以高EGCG茶樹新品系“1005”及其父母本黃旦和福云七號為材料，并利用高通量測序技術和相關軟件分析，篩選出了與茶樹EGCG生物合成密切相關的若干基因，Ankyrin基因是其中一個關鍵基因。本研究擬利用RACE技術，以“1005”新品系嫩芽為材料，在相關的轉錄組數據庫的基礎上克隆出Ankyrin基因全長序列，并對該基因及其編碼蛋白進行相關生物信息學分析；利用實時熒光定量PCR技術分析該基因在父母本和子代“1005”品系中的表達差異，確定該基因在子代及父母本的表達特性，并與EGCG含量的變化規律進行對比，分析基因表達變化與EGCG含量變化的相關性；通過與報告基因GFP融合構建表達載體進行亞細胞定位分析，從而為進一步研究茶樹EGCG代謝合成的分子機制及其調控機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料來自福建省高校農業生物技術重點實驗室選育的茶樹新品系“1005”，及普通茶樹黃旦（父本）和福云7號（母本）。采摘芽、二葉、四葉作為樣品。所有樣品分為2份，一份干燥后用于EGCG含量測定，一份立即放入液氮中，并保存在-80 ℃的冰箱，用于總RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 參照TransGen Biotech公司的 TransZolTM Up Plus RNA Kit的試劑盒提取“1005”新品系芽頭總RNA，并保存于-80 ℃。采用Fermentas公司的Rever-tAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit的試劑盒方法合成第一鏈cDNA。按照Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit合成第一鏈cDNA用于5′-RACE和3′-RACE的剿式PCR擴增。

1.2.2 茶樹CS-Ankyrin基因的克隆 參照本課題組獲得的茶樹相關轉錄組數據庫中已知的CS-Ankyrin部分序列，以“1005”品系嫩芽總RNA逆轉錄的第一鏈cDNA為模板，利用DNAMAN6.0軟件設計上下游引物Ank-F和Ank-R，驗證擴增CS-Ankyrin基因部分cDNA序列。利用測序結果得到的序列，分別設計用于擴增CS-Ankyrin cDNA3′末端序列引物Ank3′-1和Ank3′-2，5′末端序列的引物Ank5′-1和Ank5′-2，通過剿式PCR技術擴增3′末端序列和5′末端序列。用DNAMAN6.0軟件對CS-Ankyrin cDNA 3′末端序列、驗證擴增cDNA部分序列以及5′末端序列進行拼接。PCR擴增體系為：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，LATaq Mix12.5 μL，補ddH2O至總體積為25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，退火（Tm）30 s，72 ℃ ts，35個循環；72 ℃ 10 min。

將所獲得的PCR產物經電泳、染色和凝膠成像，切割回收純化目的片段，連接于pMD18-T Simple Vector（購自TAKARA公司），然后轉化到DH5α大腸桿菌感受態細胞，挑選單克隆進行PCR檢測，挑取陽性菌落送華大基因公司測序。基因克隆的引物序列、退火溫度、延伸時間見表1。

1.2.3 RT-qPCR分析 參照Pfaffl[19]和孫美蓮等[20]的方法對CS-Ankyrin基因在“1005”、黃旦和福云7號3個品種（品系）的芽、二葉、四葉3個不同發育階段葉片的表達進行實時熒光定量PCR，在基因的保守序列區域設計引物Ank-QF和Ank-QR。按照步驟1.2.1的方法提取3個品系不同發育階段葉片的總RNA，參照SYBR Ex-ScriptTM試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈，qPCR反應體系為：上下游引物各0.8 μL，cDNA模板1 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ10 μL，ddH2O補足至20 μL。加好反應程序為95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s， 40個循環，然后然后進行55～94 ℃的熔接曲線分析。以孫美蓮等[20]篩選的GAPDH基因為內參基因，反應在LightCycler480Ⅱreal-time quantity PCR儀（Roche公司）進行。RT-qPCR引物見表1。

1.2.4 EGCG含量測定 利用高效液相色譜法（HPLC）測定“1005”、黃旦、福云7號3個品種（品系）嫩芽、二葉、四葉各個樣品的EGCG含量（GB/T 8313-2008）[21]。

1.2.5 亞細胞定位分析 根據已知的CS-Ankyrin的ORF序列設計含NcoⅠ和SpeⅠ酶切位點的上下游引物AnkGFP-F和AnkGFP-R（表1），以芽cDNA為模板，擴增添加酶切位點的目的片段，并回收純化。用限制性內切酶NcoⅠ和SpeⅠ酶切pCAMBIA 1302載體以及純化的目的片段，酶切體系為：目的片段或者pCAMBIA 1302載體16 μL（總量不超過1 μg），NcoⅠ和SpeⅠ酶各1 μL，10xFast digest green buffer 2 μL，總體積20 uL，37 ℃酶切10 min，冰上終止反應，分別凝膠電泳回收純化目的片段與pCAMBIA 1302載體，然后進行連接構建瞬時表達載體pCAMBIA1302-GFP-Ank，連接體系為：pCAMBIA 1302載體0.5 μL，目的片段4.5 μL，SolutionⅠ5.0 μL，總體積10 μL。載體構建完成后，提取重組質粒并侵染農桿菌EHA105，利用農桿菌侵染轉化洋蔥表皮細胞，將轉化過的洋蔥表皮菌液稍稍慮干，平鋪于MS固體培養基，置于25 ℃培養箱共培養3 d，最后在共聚焦顯微鏡下（尼康）觀察并拍照。亞細胞定位引物見表1。

2 結果與分析

2.1 茶樹CS-Ankyrin基因全長序列克隆

在本實驗室課題組已有的茶樹轉錄組數據的基礎上，利用上下游引物Ank-F和Ank-R進行CS-Ankyrin基因部分序列的擴增，測序結果表明總長度為1 255 bp（包括上下游引物序列）。通過NCBI在線blast比對分析，得到1 255 bp序列與Genbank登錄的多種植物的Ankyrin基因高度一致，因此可認定為茶樹Ankyrin基因的部分序列。通過3′-RACE和5′-RACE兩輪剿式PCR分別擴增出CS-Ankyrin基因的3′端序列和5′序列。通過DNAMAN6.0軟件進行拼接，最后得到2 034 bp的全長序列，通過DNAMAN6.0和ORF Finder對CS-Ankyrin全長序列進行分析，開放閱讀框（ORF）為1 626 bp，起始于第354 bp，以ATG為起始密碼子，終止于第1 979 bp，以TAA為終止密碼子，編碼541個氨基酸，5′-UTR和3′-UTR長度分別為353 bp和55 bp（圖1）。將克隆得到的轉錄本核苷酸全長序列進行在線blast比對分析，與Vitis vinifera（葡萄）、 Ricinus communis（蓖麻）、Theobroma cacao（可可）和Populus trichocarpa（楊樹）的Ankyrin序列的一致性分別為78%、78%、77%和77%，結果說明所得序列為茶樹Ankyrin基因，命名為CS-Ankyrin，GenBank登錄號為KM236566。

2.2 茶樹CS-Ankyrin基因生物信息學分析

用Protparam預測分析CS-Ankyrin基因編碼蛋白的理化性質，相對分子量為58 785.9 u，等電點為9.34。該蛋白質由20種氨基酸組成，丙氨酸（Ala）等8種疏水氨基酸的含量為45.6%，甘氨酸（Gly）等12種親水氨基酸的含量為54.4%。各種氨基酸中，其中含量最高的為丙氨酸（Ala），總含量為12.0%，其次是纈氨酸（Val）9.5%，含量最少的為色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys），都僅含有0.6%。帶正電殘基總數和帶負電殘基總數分別為62和51，平均親水性為0.005，脂肪指數為100.98，推測該蛋白質為疏水蛋白，但疏水性差。Tmpred在線軟件預測CS-Ankyrin蛋白存在4個跨膜區段，為跨膜蛋白。PSORT在線軟件對CS-Ankyrin進行亞細胞定位預測分析，可以預測CS-Ankyrin蛋白最可能定位在質膜上，可能性為0.6。ScanProsite對CS-Ankyrin蛋白進行結構域分析結果顯示CS-Ankyrin錨蛋白重復序列由5個ANK單元組成（圖2），氨基酸序列分布分別為98～130、132～164、166～198、200～222、234～255。

為了比較CS-Ankyrin基因和其他物種Ankyrin基因的親緣關系，分別與葡萄、蓖麻和可可等多個物種的Ankyrin基因的全長氨基酸序列進行比對分析，結果見圖3。從構建的進化樹可以看出，茄科番茄（Solanum lycopersicum）、胡麻科芝麻（Sesamum indicum）、 茄科馬鈴薯（Solanum tuberosum）、茄科擬茸毛煙草（Nicotiana tomentosiformis）、茄科煙草（Nicotiana sylvestris）聚集在同一支上，與芝麻的親緣關系最為接近，通過NCBI在線軟件BLASTp表明，CS-Ankyrin與以上幾種植物在氨基酸水平上的一致性分別為75%、79%、75%、76%和76%。

2.3 CS-Ankyrin在不同葉位的表達分析和EGCG含量測定

采用2-△△CT法對CS-Ankyrin基因的qPCR擴增結果進行數據分析[20]，進而確定基因的相對表達量，結果見圖4。CS-Ankyrin基因在“1005”新品系，及普通茶樹黃旦和福云7號的表達趨勢一致，在芽頭相對表達水平最高，二葉次之，四葉表達水平最低。利用高效液相色譜法（HPLC）測定了不同樣品的EGCG含量，結果見圖5。在3個品種（品系）中，EGCG含量變化趨勢一樣，芽頭的EGCG含量最高，二葉次之，四葉的EGCG含量最少。通過比較發現，3個品種（品系）中不同發育階段葉片的EGCG含量變化趨勢與CS-Ankyrin基因表達趨勢一致，同時同一品種（品系）不同發育階段葉片，CS-Ankyrin基因相對表達量越高，EGCG含量越高。

“1005”新品系的EGCG含量明顯超過了2個親本，表現出了一定的雜種優勢，特別是芽和二葉；此外，與親本相比，“1005”品系CS-Ankyrin基因的相對表達量比2個親本高，本實驗結果與Yao等[22]和Stupar等[23]雜種優勢的相關理論一致。

2.4 CS-Ankyrin的亞細胞定位

為了探究CS-Ankyrin蛋白在植物亞細胞結構中的分布情況，將構建的CS-Ankyrin基因瞬時表達載體轉化到洋蔥內表皮細胞進行共培養，通過共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號，結果見圖6。從圖6可以看出，導入pCAMBIA1302-GFP空載體的洋蔥細胞，在其細胞膜、細胞質和細胞核均發出綠色熒光信號（圖6-A～C），而轉入構建好的載體pCAMBIA1302-GFP-Ank的洋蔥細胞只有在細胞膜上發出綠色熒光（圖6-D～F），說明GFP-Ank融合蛋白移動至細胞膜起作用。

3 討論與結論

錨蛋白重復系列是生物體普遍存在的一種蛋白質基序，錨蛋白重復序列一般含有2～25個不等的ANK單元，串聯形成大的ANK結構域，典型的ANK單元一般由33個氨基酸組成。錨蛋白重復序列主要是介導蛋白質之間的相互作用，ANK單元數量和附近相關序列的差異，使得含有錨蛋白序列的蛋白質功能復雜多樣。生物信息學分析表明，CS-Ankyrin蛋白與其親緣關系接近的幾種植物的Ankyrin蛋白氨基酸一致性非常高（75%以上），與其親緣關系最為接近的芝麻一致性達到79%，說明本研究克隆得到的基因為Ankyrin基因。此外，通過蛋白結構域分析表明，CS-Ankyrin錨蛋白重復序列總共有5個ANK單元組成，前3個單元均由33個氨基酸組成，具有典型ANK結構單元，進一步確定CS-Ankyrin基因為Ankyrin基因。后面2個單元為23個氨基酸和22個氨基酸組成，并不是屬于典型的ANK單元，但也有研究表明在其他基因中也見過這種現象，如INK4蛋白[24]和Nbar蛋白[25]。

一般在ANK蛋白的C-端是具有調控功能的結構域，而在N-端是膜結合位點。ANK蛋白的功能特點主要是由其結構特點和細胞定位所決定的。生物信息學表明CS-Ankyrin蛋白為疏水蛋白，且為存在4個跨膜區域的跨膜蛋白，但疏水性不強，亞細胞定位實驗表明，該蛋白主要定位在細胞膜上起作用，與PSORT在線軟件預測基本一致，這些就為CS-Ankyrin蛋白發揮作用與功能提供了條件和依據。比較3個品種（品系）中CS-Ankyrin基因的相對表達趨勢和EGCG含量變化，在同一品種（品系）中，CS-Ankyrin基因表達和EGCG含量變化趨勢呈正相關，葉片發育程度越高，CS-Ankyrin基因相對表達量越低，EGCG含量也越少。因此，初步判斷CS-Ankyrin蛋白為細胞膜上的跨膜蛋白，參與胞內物質的儲存和跨膜運輸，與擬南芥ACBP2[26]蛋白功能類似，但具體的機制有待進一步的探究。

子代“1005”品系的EGCG含量變化以及CS-Ankyrin基因表達特性均表現出了一定程度的雜種優勢，但單純的表達譜只能從基因表達量進行探究。目前在煙草、棉花、玉米等許多植物都發現了雜種優勢，并得到了很好的運用與推廣，但是雜種優勢的分子機理較為復雜，仍未完全明確，涉及核質互作、基因的甲基化、小RNA表達調控和基因表達差異等各方面。此外，從基因表達調控角度分析，生物體雜種優勢不僅涉及基因的差異表達，還包括小基因組甚至多基因的協同調控；雜種子代任何一個單基因的表達調控可能都有它自身的復雜遺傳基礎，包括劑量補償效應和表觀遺傳修飾，甚至與其他組分的相互協作都可能存在一定相關性[27]。

Ankyrin repeat錨蛋白在植物中是一個非常大的蛋白家族，在植物的生長發育、環境脅迫、信號傳導、物質運輸、疾病防疫等過程中起作用[28-31]。本研究僅根據CS-Ankyrin基因的表達特征、亞細胞定位及EGCG含量變化來推測CS-Ankyrin基因在EGCG合成中的可能作用，還需要進一步的實驗研究來闡述CS-Ankyrin的確切功能，比如在煙草通過RNAi抑制CS-Ankyrin表達，或者過量表達CS-Ankyrin基因等實驗來進一步探究其功能。

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