龍眼和番石榴根際的短針中環線蟲鑒定

楊意伯　張紹升

摘 要 短針中環線蟲[Mesocriconema brevistylus（Singh & Khera， 1976）Loof & de Grisse， 1989]采自福建省龍眼樹和番石榴樹的根際土壤中。該線蟲的形態學鑒別特征為：唇盤橢圓形，輕微隆起，唇盤兩側的側器口明顯；亞中唇瓣4個，圓形、較發達且充分分離；唇區圓，無縊縮；唇環3個，第2環寬于第1環而窄于第3環；體環126～145個，后翻、后緣光滑，蟲體側區環紋愈合；口針長54.3～66.7 μm；陰門張開，前陰唇無突起物；尾部漸細，末端鈍圓或裂葉狀。該線蟲rDNA-ITS和rDNA-D2D3區的序列大小分別為1 013和767～769 bp。短針中環線蟲為中國首次記錄，龍眼和番石榴為新發現的寄主植物。

關鍵詞 龍眼；番石榴；短針中環線蟲

中圖分類號 S436.67 文獻標識碼 A

Abstract Mesocriconema brevistylus（Singh & Khera， 1976）Loof & de Grisse， 1989 was collected from the rhizosphere of Longan and Guava in Fujian. The morphological diagnostic characters of the nematode are as follows： labial plate oval， elevated slightly， including two distinct amphidial openings laterally； four sub median lobes round， well developed， separated from each other； lip region round， continuous with body， with 3 annules， first annule narrower than second and second narrower than third； body annules 126-145， retrorse， posterior margins smooth， several anastomoses present at lateral field； stylet 54.3-66.7 μm； vulva open， anterior vulval lip with no projection； tail tapering to a lobate or obtusely rounded tip. The nematode's rDNA-ITS and 28S rDNA-D2D3 region sequence was 1 013 and 767-769 bp， respectively. M. brevistylus was firstly reported in China， longan and guava were its new host.

Key words Longan； Guava； Mesocriconema brevistylus

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.020

環科（Ciconematidae）線蟲是一類具有環型食道、體環特征明顯的植物寄生線蟲。中環屬（Mesocriconema）線蟲外寄生于寄主根系，以口針不斷穿刺根組織造成傷口，為其他病原微生物的侵染創造了條件，使根系發育不良，致使寄主地上部過早衰退死亡，如異盤中環線蟲（M. xenoplax）是梨樹早衰病的主要原因之一[1]。中環線蟲的寄主范圍廣泛，可寄生茶、水稻、麻、煙草、棗、龍眼、柑橘、芭蕉、菠蘿、香蕉、咖啡、甘蔗、草果、草坪草等多種作物、果樹和草本植物[1-6]。中國報道的中環線蟲有15種[7-9]。目前關于龍眼和番石榴根部環線蟲的研究較少，龍眼和番石榴根部環線蟲種類尚不明確。近年來作者對熱帶果樹線蟲病進行了調查，從龍眼和番石榴的果樹根際采集到1種中環線蟲，對該線蟲進行了種的鑒定，現將結果作一報道。

1 材料與方法

1.1 線蟲采集和分離

標本采集：采自福州市金山的龍眼樹和漳州市南靖的番石榴樹的根際土壤。

線蟲樣本分離和固定：用漏斗法分離線蟲，線蟲經溫熱殺死后用TAF固定液固定[1]。

1.2 線蟲種類鑒定

1.2.1 形態學觀察和顯微計測 利用光學顯微鏡對線蟲體形態、體環數目、內部器官結構進行觀察和顯微計測。計測采用de Man公式和符號：L（體長），W（體寬），a（體長/體寬），b（體長/食道長度），c（體長/尾長），V（體前端至陰門的距離×100/體長），VL（陰門至尾端的距離），VL/VB（陰門至尾端距離/陰部體寬），R（體環數），RB（蟲體中部的體環寬度），Rst（唇盤至口針基部之間的體環數），Roes（唇盤與賁門瓣之間的體環數），Rex（唇盤與排泄孔后第1環之間的體環數），Rv（陰門與尾端之間的體環數），Ran（肛門與尾端之間的體環數），Rvan（陰門與肛門之間的體環數），Stylet（口針長度），Stylet cone（針錐長度），m（針錐長度/口針長度），Oes.（食道長度），Ex.P.（排泄孔至頭端距離），Tail（尾部長度）。

利用掃描電子顯微鏡觀察線蟲體表環紋、唇部等外部結構。采用戊二醛-鋨酸雙固定法[10]制備線蟲樣本，用CO2臨界點干燥法干燥線蟲。挑取線蟲至載物臺，噴金后觀察。

1.2.2 線蟲分子鑒定 DNA提取：采用文獻[11]的方法提取單條線蟲的DNA，所得DNA提取液直接進行PCR擴增。

ITS區擴增：采用通用引物[12]S-ITS1（5′-TTGA

TTACGTCCCTGCCCTTT-3′）和p28S（5′-TTTCACTC

GCCGTTACTAAGG-3′）擴增線蟲5.8S rDNA、18S rDNA及28S rDNA之間的內部轉錄間隔區（ITS）。PCR擴增反應體系和程序與文獻[11]相同。

D2D3區擴增：通用引物[13]D2A（5′-ACAAGTA

CCGTGAGGGAAAGTTG-3′）和D3B（5′-TCGGAAGG

AACCAGCTACTA-3′）被用于擴增線蟲28S rDNA的D2D3區。PCR擴增反應體系和程序同上。

PCR產物經電泳檢測后，回收目的片段，連接PMD-18T載體，轉入DH5α大腸桿菌，通過藍白篩選3個陽性菌落測序。測序后將序列提交至NCBI數據庫進行搜索，得到該序列與其他種類中環線蟲相應序列的相似性。用軟件MEGA 6.0分析序列間同源性，從NCBI數據庫下載中環屬與其他環科線蟲的ITS和D2D3區序列，以半穿刺屬線蟲（Tylenchulus spp.）作為外群，將序列導入軟件，對齊序列，分析方法選擇“鄰接法”，“Bootstrap”選擇1 000，計算完畢后生成系統發育樹。

根據蟲體形態特征、顯微測量數據，及ITS區和D2D3區序列的比對結果，查閱相關文獻，確定具體種類。

2 結果與分析

根據光學顯微鏡和掃描電鏡的形態特征觀察及形態測量值，rDNA-ITS和28S rDNA-D2D3區序列分析結果，與相關參考文獻[14-15]比對，鑒定為短針中環線蟲[Mesocriconema brevistylus（Singh & Khera，1976）Loof & de Grisse，1989]（異名：Criconemoides brevistylus Singh & Khera，1976；Macroposthonia brevistylus（Singh & Khera，1976）Ebsary，1979；Criconemella brevistylus（Singh & Khera，1976）Luc & Raski，1981）。

2.1 測量數據（見表1）

2.2 形態描述

雌蟲：熱殺死后蟲體腹向彎曲呈“C”形（圖1-A）。體環126～145個，后翻，后緣光滑；蟲體側區環紋愈合，形成“Z”形結構（圖1-E～F；圖2-E）。唇區圓，頂端平，無縊縮；唇環3個，第1環和第2環不后翻，第3環后翻，第2環寬于第1環而窄于第3環；唇盤輕微隆起，橢圓形，具4個大的亞中唇瓣，邊緣圓滑；側器口明顯，緊靠唇盤2側（圖1-C～D；圖2-B～C）。口針粗壯，基部球前緣凹陷；環線型食道，排泄孔位于后食道球前至峽部水平處（圖1-B）。陰門張開，前陰唇無突起物（圖1-G）。陰門后的蟲體漸細呈寬圓錐形，尾部末端鈍圓或裂葉狀（圖1-G；圖2-F～G）。

雄蟲未發現。

2.3 分子生物學特征

2.3.1 ITS區序列比對 ITS擴增片段約為1 100 bp（圖3），測序后長度為1 013 bp（Genbank登錄號：KC937033）。與Genbank上已登錄的中環屬、環屬（Criconema）和擬鞘屬（Hemicriconemoides）線蟲的ITS序列的BLAST結果表明，M. brevistylus福州種群與南非種群（JQ231188）相似度最高，為99.6%；與中環屬其他線蟲M. xenoplax（FN433838，FN433849）、M. obtusicaudatus（JQ231190）和M. curvatum（HM116067）的相似度分別為95%、79%、79%和75%；與環科其他屬線蟲Criconema sphagni（JQ708133）和Hemicriconemoides spp.（EF126179、EU180057、EU664601、GQ354788和JQ911743）的相似度分別為80%和80%～83%。系統發育樹構建結果表明（圖4），M. brevistylus福州種群與中環屬線蟲親緣關系最近，以支持率81和94歸為同一聚類，與M. brevistylus南非種群同源性最高，以支持率100聚為1組。M. brevistylus福州種群與環科其他屬線蟲的同源性較低，以支持率38和41位于不同分支。

rDNA-D2D3擴增片段約為900 bp（圖3），測序后長度分別為767 bp（福州種群）和769 bp（漳州種群）（Genbank登錄號分別為KC538862和KC937033），這2個片段之間的序列相似度為99.4%。與Genbank上已登錄的中環屬、環屬、輪屬（Criconemoides）和擬鞘屬線蟲的D2D3序列的BLAST結果表明，M. brevistylus漳州種群與M. brevistylus南非種群（JQ231185）的相似度最高，為99.6%，與中環屬其他線蟲M. xenoplax（FN433856，FN433861）、M. obtusicaudatus（JQ231187）、M. solivagum（AY780969）和M. sphaerocephalum（AY780950）的相似度分別為87%～92%、90%、87%和81%，與M. ornatum（AY780968）的相似度高達97%，但比對基因覆蓋率只有70%；M. brevistylus與環科其他屬線蟲如Criconema mutabile（AY780954）、Criconemoides informis（AY780970）和Hemicriconemoides alexis（AY780959）的相似度分別為81%，83%和81%。系統發育樹構建結果表明（圖5），M. brevistylus福州、漳州種群與南非種群同源性最高，以支持率100聚為同一組；這3個種群與中環屬其他線蟲M. ornatum、M. xenoplax和M. solivagum親緣關系較近，以支持率91和70聚為一類，與屬內M. obtusicaudatus和M. sphaerocephalum親緣關系較遠，處于不同分支；與環科其他屬線蟲的親緣關系則更遠，位于不同聚類。

2.4 鑒別特征與近似種

鑒別特征：雌蟲體長439.7～649.7 μm，體環126～145個，后翻，后緣光滑，蟲體側區環紋愈合；唇區圓，頂端平，無縊縮；唇環3個，第2環寬于第1環而窄于第3環；唇盤輕微隆起，橢圓形；亞中唇瓣4個，圓形、較發達且充分分離，側器口明顯，緊靠唇盤兩側；口針長54.3～66.7 μm；受精囊不明顯，陰道直、前傾，陰門張開，前陰唇無突起物；陰門后的蟲體漸細呈寬圓錐形，尾端鈍圓或裂葉狀。

M. brevistylus的形態近似種有：方形中環線蟲（M. oblongatum）、阿普雷中環線蟲（M. apurense）和沼澤中環線蟲（M. palustre）[16-18]。這3種線蟲與M. brevistylus的區別是：體長較短（分別為390～400，

380～450和290～490 vs 439.7～649.7 μm）；M. oblongatum的口針短（41.6～44.8 μm）；M. apurense的側區體環無愈合；M. palustre口針短（46～52 μm）、2個背亞中唇瓣和2個腹亞中唇瓣分別在唇區背、腹面相連。

3 討論與結論

短針中環線蟲福州、漳州種群的形態特征及測量值均與原始描述[14]相符，形態學、分子生物學特征與南非種群[15]相符。但是與原始描述相比，福州種群體環較少（126～145 vs 140～156），漳州種群體環較少（128～132 vs 140～156）而口針較長（59.2～66.7 vs 56～60 μm），這2個種群雌蟲的陰門張開，而原始描述的線蟲墨線圖顯示陰門閉合。與南非種群相比，福州種群體環較少（126～145 vs 137～161），漳州種群體環較少（128～132 vs 137～161）、Rex略小（28～36 vs 34～43）、c值略小（16.6～18.7 vs 18～27.5）和口針較長（59.2～66.7 vs 54.5～61 μm）。福州種群與漳州種群的差異在于口針較長（54.3～60.7 vs 59.2～66.7 μm）和Rex略小（33～37 vs 28～36），上述這些差異可能是種群地理分布不同和寄主不同引起的。

據國外報道龍眼根際的中環線蟲為圓頭中環線蟲（M. sphaerocephalum）[18]，番石榴根際有多種中環線蟲（Mesocriconema spp.）[18-20]。國內龍眼和番石榴根際的中環線蟲尚未見報道。福建省其他作物根際的中環線蟲種類有：裝飾中環線蟲（M. ornatum）、彎曲中環線蟲（M. curvatum）和異盤中環線蟲（M. xenoplax）[2-3]。M. brevistylus福州種群和漳州種群的唇盤輕微隆起，體環126～145個，前陰唇無突起物，這些特征與上述3種中環線蟲都有顯著區別：M. ornatum的體環96～106個，前陰唇有2個穗狀突起；M. curvatum的體環84～95個；M. xenoplax的唇盤明顯隆起，體環82～90個。

據報道短針中環線蟲分布于印度的蔬菜和南非的草坪草[14-15]。短針中環線蟲為中國首次記錄，龍眼和番石榴為新發現寄主植物。目前Genbank有該線蟲南非種群的ITS和D2D3區序列數據，國內首次登錄該線蟲的ITS和D2D3區序列。

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