齡家蠶中腸β—呋喃果糖苷酶基因轉錄表達分析

楊偉克　唐芬芬　劉增虎　鐘健

摘要：【目的】探明5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶基因表達及其酶活性變化規律，為解析家蠶回避桑葉1-脫氧野尻霉素（DNJ）毒害作用的適應機制提供參考依據?！痉椒ā客ㄟ^實時熒光定量PCR對5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1和BmSuc2的表達進行定量檢測和分析，同時測定β-呋喃果糖苷酶活性。【結果】BmSuc1基因在5齡家蠶中腸的不同發育階段均有表達，其中在5齡起蠶和盛食期的相對表達量較高；而BmSuc2基因在整個5齡期的相對表達量均非常低。從5齡起蠶到熟蠶，β-呋喃果糖苷酶活性呈先升高后降低的變化趨勢，以第5 d（盛食期）的酶活性最高，達158.82 U/mg?！窘Y論】BmSuc1基因表達水平及β-呋喃果糖苷酶活性變化規律與5齡家蠶吸收利用桑葉蔗糖營養的生理進程基本一致，提示BmSuc1基因作為一種蔗糖水解酶基因在家蠶中腸組織消化吸收桑葉蔗糖營養物質的過程中發揮主導作用。

關鍵詞： 家蠶；β-呋喃果糖苷酶；BmSuc1基因；BmSuc2基因；酶活性

中圖分類號： S881.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）05-0721-05

Abstract：【Objective】In order to provide reference for illustrating adaptive mechanism of Bombyx mori avoiding toxicity of 1-deoxynojirimycin（DNJ）， the present study was conducted to investigate change regularities of β-fructofuranosidase gene expression and its enzyme activity in the midgut of the 5th instar B. mori larvae. 【Method】The real-time fluorescent quantitative PCR was applied to analyze expression of BmSuc1 and BmSuc2 genes in midgut of the 5th instar B. mori larvae， meanwhile the activities of β-fructofuranosidase were determined. 【Result】BmSuc1 gene was expressed in midgut of the 5th instar larvae at different developmental stages， moreover it was highly expressed at moulting and glutonous stages of the 5th instar larvae， while BmSuc2 gene was lowly expressed all the time at the 5th instar of larvae. Furthermore， the activity of β-fructofuranosidase showed a trend of ascending first and then descending from newly moulted silkworm to matured silkworm， especially at the 5th day of glutonous stage with the highest enzyme activity（158.82 U/mg）. 【Conclusion】The expression level of BmSuc1 gene and Chang of β-fructofuranosidase activity are corresponded with mulberry sucrose metabolism in the 5th instar larvae， therefore， it is revealed that BmSuc1 gene plays a leading role in midgut absorbing sucrose nutrition from mulberry leaves.

Key words： Bombyx mori； β-fructofuranosidase； BmSuc1 gene； BmSuc2 gene； enzymatic activity

0 引言

【研究意義】1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）能夠抑制α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）活性，但對β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）沒有抑制作用（Krasikov et al.，2001；Kiso et al.，2003）。DNJ能夠通過抑制昆蟲腸道α-葡萄糖苷酶活性而阻止昆蟲分解和吸收蔗糖營養，使其不能正常生長發育，甚至造成死亡（Kite et al.，1997；Asano et al.，2001）。桑樹的葉片、枝條和根莖等部位均富含DNJ，寡食性昆蟲家蠶一生以桑葉為食物來源，之所以能有效避開桑葉DNJ對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，主要是依賴β-呋喃果糖苷酶分解吸收桑葉中的蔗糖營養（Asano et al.，2001；Daimon et al.，2008；張蕾等，2014）。家蠶5齡期是食桑量最大的階段，研究此階段β-呋喃果糖苷酶基因在家蠶中腸的表達變化規律，解析家蠶中腸蔗糖水解酶的功能及其活性，對闡明家蠶回避桑樹生物堿DNJ毒害作用的酶學適應機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】蔗糖是包括昆蟲在內所有動物的主要營養來源，分解蔗糖的水解酶有兩種：一種是催化葡萄糖側基的α-葡萄糖苷酶，另一種是催化果糖側基的β-呋喃果糖苷酶（Krasikov et al.，2001）。α-葡萄糖苷酶普遍存在于動植物和微生物中，但動物體內不存在β-呋喃果糖苷酶、其蔗糖消化吸收主要依賴于α-葡萄糖苷酶水解作用的觀點長期存在，影響著人們的科學判斷（Krasikov et al.，2001；Alberto et al.，2004）。早期的研究有報道β-呋喃果糖苷酶存在于少數幾種昆蟲的腸液中（Santos and Terra，1986；Sumida et al.，1994；Carneiro et al.，2004），但一直未見相關基因的克隆鑒定。直到2008年，Daimon等率先在家蠶基因組中發現兩個與細菌性β-呋喃果糖苷酶基因具有較高同源性的基因，分別命名為BmSuc1和BmSuc2，且證實其編碼的蛋白質在家蠶中腸中具有β-呋喃果糖苷酶活性特征。另外，有研究表明非食桑昆蟲蓖麻蠶和柞蠶的體內也存在β-呋喃果糖苷酶同源基因，其中蓖麻蠶有2個（ScSuc1和ScSuc2），柞蠶有3個（ApSuc1a、ApSuc1b和ApSuc2），但這些基因都不具備β-呋喃果糖苷酶的活性特征，說明β-呋喃果糖苷酶與食桑/非食桑昆蟲的食性選擇密切相關（張蕾，2014）?！颈狙芯壳腥朦c】食桑昆蟲家蠶分解桑葉中的蔗糖主要依賴于β-呋喃果糖苷酶而非α-葡萄糖苷酶，因此桑葉中高濃度的DNJ對其無毒害作用。目前，關于家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶活性及BmSuc1和BmSuc2基因表達的變化規律尚無研究報道?！緮M解決的關鍵問題】通過實時熒光定量PCR檢測整個5齡期家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶基因的表達量，并測定此時β-呋喃果糖苷酶的活性，旨在探明BmSuc1和BmSuc2基因及β-呋喃果糖苷酶在5齡家蠶中腸的變化規律，為解析家蠶回避桑葉生物堿DNJ毒害作用的適應機制提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試家蠶為菁松×皓月，人工孵化，飼育溫度25.5～ 28.0 ℃，濕度60%～70%，桑葉飼養。取5齡起蠶至熟蠶的中腸組織，每頭蠶的中腸組織縱切分成兩份，一份用于抽提RNA，另一份用于酶活性測定。每次取樣均設3次重復，每個重復取5頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃下保存備用。RNAiso Plus、反轉錄試劑盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Taq DNA聚合酶和熒光定量試劑SYBR■ Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）均購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白定量測試盒（A045-2）與β-呋喃果糖苷酶活性試劑盒（A082-2）購自南京建成生物工程研究所。

1. 2 RNA提取及反轉錄

按照RNAiso Plus試劑操作說明提取中腸總RNA，得到的總RNA用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行處理以去除基因組DNA。通過上述方法制備獲得的RNA用DEPC水進行1∶50稀釋，然后于核酸蛋白分析儀上分別測出OD260和OD280，通過OD260/OD280計算RNA樣品濃度；并根據PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒使用說明將RNA反轉錄成cDNA。另外，取OD260/OD280在1.80～2.00的樣品用于實時熒光定量PCR檢測。

1. 3 引物設計與合成

利用Primer Premier 5.0軟件，按照Real-time PCR要求設計引物。引物序列見表1。

1. 4 目的基因PCR擴增

進行熒光定量PCR檢測前，需對設計的引物進行普通PCR檢測。一是鑒定引物的特異性及是否有引物二聚體產生；二是初步檢測目標基因在家蠶中腸的大概轉錄情況，為實時熒光定量PCR檢測提供定性參考。利用表1中的引物，以反轉錄獲得的家蠶中腸cDNA為模板進行PCR擴增。擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環；最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，即在5 v/cm電壓下電泳25～30 min，然后在UVP凝膠成像系統上觀察并攝影。

1. 5 實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR檢測參照SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明進行操作。擴增程序：95 ℃預變性1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環。StepOne熒光定量PCR擴增儀記錄試驗結果，每個樣品設3次重復，最后根據2-△△Ct計算基因的相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 6 β-呋喃果糖苷酶活性測定

取家蠶中腸樣品加入4 ℃預冷的1.0 mL磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），在冰上勻漿，4 ℃下8000 r/min離心5～8 min，收集上清液。按照蛋白定量試劑盒說明測定蛋白質含量，再根據β-呋喃果糖苷酶測定試劑盒說明測定酶活性。

1. 7 統計分析

采用Excel 2007進行數據處理及制圖，利用SPSS 13.0進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 目的基因的PCR擴增結果

由圖1可以看出，從5齡家蠶中腸組織中能分別擴增出單一的BmSuc1和BmSuc2基因條帶，且沒有明顯的引物二聚體條帶出現，說明本研究設計的引物可用于實時熒光定量PCR擴增。另外，通過比較擴增片段條帶的寬窄、深淺，發現BmSuc1基因的條帶較亮，而BmSuc2基因的條帶很弱，表明BmSuc1與BmSuc2基因的轉錄水平存在差異，但其差異需要通過實時熒光定量PCR檢測才能進行準確分析。

2. 2 5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶基因的表達情況

利用實時熒光定量PCR對5齡起蠶至熟蠶的中腸β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1和BmSuc2進行定量分析，結果如圖2所示。由圖2可以看出，BmSuc2基因轉錄表達波動較小，從5齡起蠶到熟蠶的相對表達量都非常低；而BmSuc1基因在整個5齡期的相對表達量存在很大差異，其中5齡起蠶時的相對表達量較高，取食第1 d的BmSuc1基因相對表達量有一定程度的降低，從第2 d開始逐漸升高，在第4 d的相對表達量最高，第5 d又開始降低，到第7～8 d降至最低點。BmSuc1基因在整個5齡期呈先減弱后升高再降低的變化趨勢，出現一個峰值。說明BmSuc1與BmSuc2基因在5齡家蠶中腸的轉錄表達規律不一致。

2. 3 5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶的活性變化

5齡家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶的活性變化情況如圖3所示。由圖3可知，從5齡起蠶到熟蠶，β-呋喃果糖苷酶活性呈先升高后降低的變化趨勢。5齡起蠶到取食第2 d，β-呋喃果糖苷酶活性變化不明顯，維持在80.00 U/mg左右，從第3 d開始酶活性開始逐漸升高，第5 d的酶活性最高（158.82 U/mg），隨后酶活性逐漸降低，到熟蠶期降至最低（39.25 U/mg）。

3 討論

家蠶基因組中存在兩個β-呋喃果糖苷酶基因（BmSuc1和BmSuc2），其中，BmSuc1基因在家蠶中腸組織中特異性表達，且具有完全酶學功能；BmSuc2基因在家蠶中腸表達量極低，序列比對分析結果顯示，BmSuc2基因缺少酶活性位點，故推測其表達產物不具有β-呋喃果糖苷酶活性（Daimon et al.，2008）。本研究利用實時熒光定量PCR檢測到BmSuc1基因在5齡家蠶中腸組織均有一定的表達量，其中在5齡起蠶和盛食期的表達量相對較高；而BmSuc2基因在整個5齡期表達量都非常低，幾乎檢測不到。據此推測，BmSuc1作為一種蔗糖水解酶在家蠶中腸組織消化吸收蔗糖營養物質的過程中發揮主導作用。

家蠶中腸主要是負責營養物質的消化與吸收，桑葉中的大分子如糖類、蛋白質和脂類物質首先在中腸消化液的作用下分解成小分子化合物，經中腸上皮細胞吸收，再通過血液運輸到其他組織器官，從而為其生長發育等生命活動提供能量（屠杰和王國基，2005；侯勇等，2007；張賽，2011）。蔗糖是許多昆蟲喜好的主要糖類營養來源，昆蟲中腸組織的β-呋喃果糖苷酶可將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，為機體提供糖源（Krasikov et al.，2001；Barp et al.，2011）。桑葉中的生物堿D-ABI和DNJ等是α-葡萄糖苷酶的強效抑制劑，對非食桑昆蟲卷心菜蛾和蓖麻蠶等具有極高的毒性作用（Konno et al.，2006；Hirayama et al.，2007），家蠶卻以桑葉作為唯一的食物來源。已有研究表明，家蠶是利用β-呋喃果糖苷酶將桑葉中的蔗糖水解為可利用的單糖，供蠶體吸收利用（Daimon et al.，2008；張蕾，2014）。本研究結果顯示，β-呋喃果糖苷酶活性在家蠶的整個5齡期呈先升高后降低的變化趨勢，其活性變化規律與該階段蠶體吸收利用桑葉糖營養的生理進程基本一致，5齡家蠶一般在第4～5 d達到盛食期，β-呋喃果糖苷酶活性即在第4～5 d相對較高，BmSuc1基因表達量也在第4 d最高。盛食期家蠶對桑葉及糖營養的需求量很大，蠶體攝入大量桑葉，即需要更多蔗糖水解酶消化吸收蔗糖營養，此時蔗糖水解酶基因大量表達，其酶活性維持在一個相對較高的水平。

4 結論

BmSuc1基因表達水平及β-呋喃果糖苷酶活性變化規律與5齡家蠶吸收利用桑葉蔗糖營養的生理進程基本一致，提示BmSuc1基因作為一種蔗糖水解酶基因在家蠶中腸組織消化吸收桑葉蔗糖營養物質的過程中發揮主導作用。

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（責任編輯 蘭宗寶）