茭白線粒體蛋白雙向電泳體系建立

杜傳來　羅海波　彭昕　王韋華　郁志芳

摘要：【目的】建立適合于茭白線粒體蛋白質組分析的雙向電泳技術體系，為進一步開展茭白線粒體差異蛋白質組學研究提供參考。【方法】以茭白為試驗材料，比較不同線粒體提取純化方法、IPG膠條pH范圍及蛋白上樣量等條件對雙向電泳圖譜的影響。【結果】差速離心（3000～14000×g）聯合Percoll不連續密度梯度離心（20%∶24%∶40%=2∶4∶2）對茭白線粒體的提取純化效果優于僅采用差速離心。采用改良酚抽法提取茭白線粒體蛋白，17 cm、pH 3～10的IPG膠條，1.0 mg上樣量，12% SDS-PAGE進行雙向電泳，0.12%考馬斯亮藍G-250膠體考染法染色，茭白線粒體蛋白主要分布在pH 4～8范圍內，pH 3～4和pH 8～10范圍內蛋白點較少；進一步選用pH 4～7和pH 5～8的IPG膠條對茭白線粒體蛋白進行雙向電泳，分離效果均明顯提高，且pH 4～7范圍內IPG膠條的雙向電泳圖譜清晰，蛋白點分辨率較高。分別采用0.8、1.0和1.2 mg 3個不同的上樣量進行雙向電泳，結果表明上樣量為1.0 mg時，電泳圖譜質量最好。【結論】通過差速離心聯合Percoll不連續密度梯度離心提取純化茭白線粒體，并控制好雙向電泳體系的pH范圍、上樣量等因素，可獲得蛋白質點清晰、分辨率高、重復性好的雙向電泳圖譜。

關鍵詞： 茭白；線粒體；雙向電泳；蛋白質組學

中圖分類號： Q81 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0332-05

0 引言

【研究意義】線粒體是存在于絕大多數真核細胞內的一種重要細胞器，是細胞進行呼吸氧化、電子傳遞、三羧酸循環和氧化磷酸化的場所，也是產生能量的場所；在信號轉導和細胞程序性死亡過程中，線粒體也發揮著重要作用。這些復雜生理功能的實現與線粒體內含有的多種蛋白質密切相關（田世平等，2011；黃鳳蘭等，2012）。因此，進行線粒體蛋白質組學研究有助于更好地闡明線粒體的生理功能及其在生命活動中的作用。【前人研究進展】目前，國內外關于線粒體蛋白質組學的研究已有相關報道。Millar等（2001）對擬南芥培養細胞的線粒體蛋白進行雙向電泳分析，從雙向電泳圖譜上可分辨出大約100個高豐度線粒體蛋白和250個低豐度線粒體蛋白。Millar等（2004）研究了水稻幼苗在6 d缺氧后1 d有氧適應期和7 d有氧條件下線粒體蛋白的表達差異，發現缺氧條件下呼吸氧化相關酶活性顯著升高，同時細胞色素C氧化酶豐度顯著低于對照。Qin等（2009a，2009b）研究了蘋果和桃果實衰老過程中的線粒體蛋白質組，發現三羧酸循環、電子傳遞鏈、碳水化合物代謝及抗脅迫相關蛋白存在表達差異，尤其在高氧脅迫下錳超氧化物歧化酶表達量顯著上調。此外，應用線粒體蛋白質組學技術揭示植物細胞質雄性不育機理方面也有研究報道（郭寶健等，2007；陳鵬等，2011）。關于茭白蛋白質組學的研究，目前主要集中在總蛋白質組差異表達方面。Luo等（2012）研究了鮮切茭白冷藏期間的蛋白質表達差異，結果表明，切分誘導了茭白自身抗氧化和抗病原菌系統，但也不可避免地加速了茭白細胞結構的解體和衰老。羅海波等（2014）研究了茭白冷藏期間蛋白質表達譜的變化，發現物質代謝過程的調整、能量代謝途徑的改變、活性氧清除能力的減弱及細胞結構的解體可能是導致茭白采后衰老的重要原因。【本研究切入點】植物細胞具有細胞壁，從植物中提取線粒體相對動物細胞而言需增加移除細胞壁的離心程序，限制了植物材料線粒體蛋白質組學的深入研究。目前已有研究針對擬南芥和水稻等模式作物生長發育或脅迫條件下線粒體蛋白質組的變化，但在其他植物材料中有關線粒體蛋白質組學的研究較少，關于茭白線粒體蛋白質組學的研究也未見報道。【擬解決的關鍵問題】以茭白為研究對象，擬通過對茭白線粒體提取純化方法及雙向電泳條件的優化，建立適合于茭白線粒體蛋白質分離的雙向電泳技術體系，為進一步開展茭白線粒體差異蛋白質組學研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用茭白購自南京市衛崗菜市場，選擇大小一致、無病蟲害及機械損傷的茭白，自來水沖洗后剝去外殼葉鞘，迅速用液氮冷凍，-70 ℃保存備用。

主要儀器設備：Beckman高速冷凍離心機（AJ-30i Beckman公司）、Beckman超速冷凍離心機（OptimaL- 100XP Beckman公司）、等電聚焦電泳系統（ProteinI12IEF 美國伯樂公司）、高重復性高通量大型垂直電泳儀（EttanDALTTwelve GE-061-TY7119 GEHealthcare）和ImageScanner Ⅲ掃描儀（28-9076-07 GEHealthcare）。

主要試劑：牛血清蛋白（BSA）、Percoll、Tris平衡酚、兩性電解質（Bio-Lyte）、丙烯酰胺（Arc）、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、考馬斯亮藍G-250等，均為AR級。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 線粒體提取 參照祝美云等（2012）的方法。稱取茭白400 g，加入4 ℃預冷的提取液[內含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1%（w/v）BSA、0.5%（w/v）PVP-30、0.1%（w/v）半胱氨酸]800 mL，在組織勻漿機中勻漿3次，每次15 s，然后用4層紗布過濾，濾液在4 ℃下3000×g離心20 min，取上清液在4 ℃下14000×g離心20 min，將沉淀用80 mL洗滌液[內含10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1% BSA]洗滌，4 ℃下14000×g離心20 min，重復洗滌步驟，得到的沉淀即為粗線粒體。

1. 2. 2 線粒體純化 參照Qin等（2009b）的方法。將粗線粒體用12 mL懸浮液（內含10 mmol/L Tris-HCl、0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA）懸浮，然后將粗線粒體懸浮液小心鋪在20%∶24%∶40%（2∶4∶2）Percoll（10 mmol/L Tris-HCl、0.3 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA）不連續密度梯度上，4 ℃下45000×g離心45 min，取24%/40%層不透明淺黃色線粒體環，用50 mL懸浮液洗滌，4 ℃下14000×g離心20 min，重復洗滌步驟，沉淀即為高純度線粒體。

1. 2. 3 線粒體蛋白提取與含量測定 線粒體蛋白提取純化參照Luo等（2012）的改良酚抽法進行。在純化前或純化后的線粒體沉淀中加入10 mL裂解液[內含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、2%（v/v）β-巰基乙醇、1 mmol/L PMSF]，冰浴中進行超聲波降解30 min，得到線粒體蛋白液。蛋白質含量參照Bradford（1976）的方法進行測定。

1. 2. 4 雙向電泳 參照Luo等（2012）的方法。第一向等點聚焦采用17 cm的Bio-Rad公司IPG膠條，等點聚焦pH選取pH 3～10、pH 4～7、pH 5～8等3個梯度，上樣體積均為350 μL，上樣量分別設置0.8、1.0和1.2 mg。等點聚焦程序：50 V 12.0 h、100 V 1.0 h、200 V 1.0 h、500 V 1.0 h、1000 V 1.0 h、4000 V 2.0 h、8000 V 9.5 h，儀器運行條件為20 ℃，每根膠條極限電流30 μA。聚焦結束后，轉入第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度12%，恒定功率每根膠條1 W運行1.5 h，然后每根膠條15 W運行4.0 h，直到溴酚藍前沿到達凝膠底部終止電泳，用0.12%考馬斯亮藍G-250膠體考染法染色。

1. 2. 5 凝膠圖像采集與分析 凝膠圖像用ImageScanner Ⅲ掃描儀進行采集，保存為GSC的圖像文件，用PDQuest 8.0.1軟件進行圖像處理。

2 結果與分析

2. 1 線粒體的提取純化

分別取純化前的粗線粒體沉淀和純化后的線粒體沉淀，用改良酚抽法提取線粒體蛋白進行雙向電泳分析，比較兩種線粒體提取純化方法對雙向電泳效果的影響。如圖1所示，僅采用差速離心獲得的粗線粒體蛋白經雙向電泳后雙向電泳圖譜（圖1-A）清晰，蛋白點較多；而采用差速離心聯合Percoll不連續密度梯度離心獲得的線粒體蛋白經雙向電泳后雙向電泳圖譜（圖1-B）分辨率較高，純化前雙向電泳圖譜上出現的部分蛋白質點在純化后未出現，同時純化前未出現的蛋白質點在純化后的雙向電泳圖譜上清晰顯現，表明經Percoll不連續密度梯度離心后線粒體純度明顯提高，同時部分線粒體蛋白質得到有效濃縮。

2. 2 IPG膠條pH范圍對雙向電泳效果的影響

為獲得適合于茭白線粒體蛋白分離的IPG膠條pH范圍，用改良酚抽法提取茭白粗線粒體蛋白，采用17 cm、pH 3～10的IPG膠條、1.0 mg上樣量、12% SDS-PAGE進行雙向電泳，0.12%考馬斯亮藍G-250膠體考染法染色。圖2-A顯示，茭白線粒體蛋白主要分布在pH 4～8范圍內，pH 3～4和pH 8～10范圍內蛋白點較少，但pH 4～8范圍內的蛋白點過于集中且出現重疊現象，表明pH 4～8可能是茭白線粒體蛋白分離的適宜pH。進一步選用pH 4～7和pH 5～8的IPG膠條對茭白線粒體蛋白進行雙向電泳，發現分離效果均明顯提高，pH 3～10范圍內未分開的點在pH 4～7范圍（圖2-B）和pH 5～8（圖2-C）范圍內均能有效分開，且點跡清晰，僅少數高豐度大分子量蛋白點有重疊。圖2-B和圖2-C還顯示，pH 4～7范圍內IPG膠條的雙向電泳圖譜清晰，蛋白點分辨率較高，但pH 7～8范圍內存在蛋白點丟失現象；pH 5～8范圍內IPG膠條的雙向電泳圖譜清晰，pH 7～8范圍內蛋白點完全分開，但pH 4～5范圍內蛋白點丟失，且部分蛋白點仍存在重疊現象，未能有效分開。

2. 3 不同上樣量對雙向電泳效果的影響

17 cm的IPG膠條采用考馬斯亮藍染色法顯色，其適宜的上樣量在1.0 mg左右（趙玲玲等，2015）。因此，本研究在其他條件相同的情況下，分別取改良酚抽法獲得的茭白粗線粒體蛋白樣品0.8、1.0和1.2 mg進行分析。上樣量為0.8 mg時，雖然雙向電泳圖譜背景清晰、蛋白質點較多且無拖尾現象，但低豐度蛋白點很少，部分低豐度蛋白未能在圖譜上顯現，在一定程度上影響了雙向電泳的準確性和重復性（圖3-A）；上樣量為1.0 mg時，蛋白質點數較多、清晰且分布均勻，低豐度蛋白得到很好呈現，僅少量高豐度大分子量蛋白質存在重疊現象，圖譜質量較好（圖3-B）；上樣量提高至1.2 mg時，低豐度蛋白質點明顯增多，但高豐度蛋白質斑點過大，未能有效分開，造成交叉重疊，影響其他蛋白點的分離與分析，甚至出現橫向拖尾現象（圖3-C）。

3 討論

3. 1 線粒體提取純化方法

線粒體的純度是影響線粒體蛋白質組學研究的重要因素。目前，線粒體分離純化主要采用差速離心聯合密度梯度離心的方法。有研究表明，可使線粒體有效分離的離心力為3000～13000×g，經過多次差速離心也可純化線粒體，但離心工作量很大且獲得的線粒體純度不高（賀芳和何大澄，2005）。密度梯度離心可將差速離心獲得的粗線粒體進一步純化，有效去除其他細胞器蛋白質的污染，提高純化效率。密度梯度離心常用的介質主要有氯化銫、蔗糖、Ficoll、Percoll及Nycodenz等，其中蔗糖和Percoll在植物細胞線粒體的分離中較常用（施蘇雪等，2012）。Qin等（2009b）采用1200～17000×g差速離心聯合8%∶12%∶30%=2∶4∶1 Percoll不連續密度梯度離心和21% Percoll自形成密度梯度離心提取純化蘋果線粒體，獲得可用于蛋白質組分析的高純度線粒體。本研究選用3000～13000×g差速離心聯合Percoll不連續密度梯度離心（20%∶24%∶40%=2∶4∶2）后可獲得較理想的純化效果。

3. 2 IPG膠條pH范圍

IPG膠條pH范圍選擇是影響雙向電泳圖譜蛋白質分辨率和靈敏度的重要因素。合適的IPG膠條pH范圍可獲得背景清晰、分辨率和靈敏度均較高的雙向電泳圖譜，反之則可能使分子量和等電點相近的蛋白質難以有效分離，或丟失其pH范圍之外的有用蛋白。陳征等（2013）研究比較了不同膠條長度及pH范圍對小麥小花線粒體蛋白雙向電泳圖譜的影響，結果發現蛋白質點主要集中在pH 4～7范圍內，采用17 cm、pH 4～7的IPG膠條能夠更好地聚焦分離小麥小花線粒體蛋白質組。李建友（2007）對鹽脅迫誘導水稻根尖細胞程序性死亡早期線粒體蛋白質組變化的研究表明，pH 4～7是分離水稻根尖細胞線粒體蛋白的適宜范圍。而Qin等（2009a）研究發現，桃果實線粒體蛋白質采用pH 3～10范圍內的IPG膠條進行雙向電泳可獲得質量較好的雙向電泳圖譜。本研究首先采用pH 3～l0的IPG膠條對茭白線粒體蛋白質進行分離，發現茭白線粒體蛋白質主要分布在pH 4～8范圍內，因而改用pH 4～7和pH 5～8的IPG膠條進一步雙向電泳分離，最終確定采用pH 4～7適宜于茭白線粒體蛋白質的分離，分離效率和分辨率均顯著提高。

3. 3 上樣量的選擇

蛋白質上樣量是影響雙向電泳圖譜清晰度及蛋白質點多少的另一重要因素。上樣量過低導致蛋白質點較少，低豐度蛋白顏色較淺且難以發現，造成部分蛋白信息丟失；上樣量過高會導致高豐度蛋白點過大而掩蓋相對分子質量和等電點相近的其他重要低豐度蛋白（張僑等，2010）。研究表明，上樣量不僅與染色方法及IPG膠條長度有關，還與IPG膠條pH范圍、高豐度和低豐度蛋白的分布等有關（羅海波等，2013）。因此，在染色方法、IPG膠條長度、上樣方法等均一致的條件下，對上樣量進行優化是提高雙向電泳圖譜質量的有效途徑。Qin等（2009a）對桃果實線粒體蛋白質雙向電泳體系研究表明，采用13 cm、pH 3～10的IPG膠條，最適蛋白上樣為0.6 mg。本研究選用17 cm、pH 4～7的IPG膠條、考馬斯亮藍G-250染色，比較了0.8、1.0和1.2 mg不同上樣量的雙向電泳結果，發現上樣量為1.0 mg時得到電泳圖譜蛋白質點數量多，分辨率較高，重疊現象少。

4 結論

本研究結果表明，通過差速離心聯合Percoll不連續密度梯度離心提取純化茭白線粒體，并控制好雙向電泳體系的pH范圍、上樣量等因素，可獲得蛋白質點清晰、分辨率高、重復性好的雙向電泳圖譜。

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（責任編輯 王 暉）