灰樹花交配型鑒定分析

楊軍　徐吉　宋一鳴　朱堅

摘要：【目的】鑒定灰樹花交配型，為灰樹花雜交育種提供理論依據。【方法】灰樹花孢子萌發后挑取單孢進行鏡檢，收集孢子單核體；采用原生質體單核化獲得原生質體單核體并通過互配確定標準測交菌株T1和T2；采用標準測交菌株與孢子單核體配對及孢子單核體互配后，進行孢子單核體交配型分類，并利用核遷移試驗和OWE-SOJ技術鑒定孢子單核體交配型。【結果】分離鑒定獲得71株灰樹花孢子單核體菌株，原生質體單核化獲得17株原生質體單核體菌株，其中標準測交菌株T1（A1B1）10株、T2（A2B2）7株；鑒定71株孢子單核體分別為T1、T2、T3和T4型，其中T1型28株、T2型35株、T3型 4株、T4型4株；核遷移試驗鑒定T1、T2、T3和T4的交配型分別為A1B1、A2B2、A2B1和A1B2，OWE-SOJ鑒定結果分別為A1B1、A2B2、A1B2和A2B1。【結論】灰樹花屬于四極性交配型系統，其交配型分析應以核遷移試驗為準，OWE-SOJ技術不適用于灰樹花的交配型分析。

關鍵詞： 灰樹花；單核體；OWE-SOJ技術；核遷移試驗；交配型

中圖分類號： S646.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0412-07

0 引言

【研究意義】灰樹花（Grifola frondosa）又名貝葉多孔菌、蓮花菇、舞茸（日本）等，分類學上隸屬于真菌門、擔子菌綱、無褶菌目、多孔菌科、樹花菌屬，是食、藥兼用蕈菌（徐錦堂，1997）。灰樹花食味鮮美，富含多種維生素、礦物質及生物活性物質，其多糖具有抗腫瘤、改善免疫系統、抗HIV病毒、調節血糖和血脂及膽固醇水平等作用（李小定等，2003），具有極高的利用價值，市場上對其需求量不斷增加。有性生殖對食用菌子實體發育和種群多樣性及其雜交育種非常重要，學者對食用菌交配系統及交配行為的研究從未間斷，但對灰樹花的交配型分析未見報道。因此，鑒定灰樹花交配型及其交配型系統，對選育更優良高產的灰樹花品種具有重要意義。【前人研究進展】近年來，有關灰樹花的研究主要集中在活性成分方面（郭予斌等，2011；王帥和李杰，2014；朱小華等，2014），遺傳育種方面的研究較少（徐志祥等，2004；劉振偉和史秀娟等，2005；郭家瑞等，2010）。林芳燦等（2000）、程莉等（2007）、陳裕新等（2012）研究表明，OWE-SOJ技術可應用于香菇、側耳、靈芝等食、藥用菌的交配型分析。針對交配型研究，李安政和林芳燦（2013）認為，除在核遷移發生部位、范圍不規則時應注意對交配型結果進行審慎分析和驗證外，核遷移試驗是交配型因子鑒定中一種便捷而準確的研究手段。有關食用菌交配型的研究結果顯示，黑木耳（張紅等，2002）、大球蓋菇（汪虹和曹暉，2006）、金福菇（傅俊生等，2007）和雞腿菇（尹清玉和李林輝，2008）等菌類是四極性交配型系統。【本研究切入點】目前，關于灰樹花交配型鑒定的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】在借鑒其他食用菌交配型研究的基礎上，分離、鑒定灰樹花孢子單核體極性，并利用核遷移試驗和OWE-SOJ技術準確鑒定其交配型，為灰樹花雜交育種提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 菌株 供試菌株庫藏編號Gr0001+3源自東北食藥用菌研究所的白灰樹花，由福建省食用菌種質資源保藏管理中心提供。

1. 1. 2 培養基 PDA培養基（g/L）：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g。原種培養基（質量比）：木屑75.0%（粗∶細=1∶2），麥麩8.0%，玉米粉15.0%，蔗糖1.0%，石膏1.0%，配方水含量65.0%。栽培袋培養基（質量比）：木屑45.0%（粗∶細=1∶3），棉籽殼30.0%，麥麩8.0%，玉米粉15.0%，過磷酸鈣1.0%，蔗糖1.0%，配方水含量65.0%。MYG再生培養基：麥芽糖5.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖10.0 g，維生素B1 30.0 mg，溶于1.0 L 0.6 mol/mL甘露醇。OWE培養基：5.0%橡樹木屑浸汁200.0 mL，瓊脂20.0 g，加蒸餾水定容至1.0 L。SOJ培養基：鮮榨橘汁200.0 mL，瓊脂20.0 g，加蒸餾水定容至1.0 L。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 灰樹花栽培 在23～25 ℃下菌絲走菌滿袋后、原基開始形成時移入特定條件菇房出菇。菇房條件：溫度16～18 ℃，濕度85%～95%，光照強度200～500 lx，二氧化碳濃度不高于1000 mg/L。形成豬腦狀原基時，開袋出菇。

1. 2. 2 孢子單核體分離、鑒定 摘取已成熟的灰樹花子實體，用75%酒精噴灑消毒，在超凈工作臺上用滅菌鑷子撕取灰樹花菇片置于已滅菌的硫酸紙上，菇片具菌管一面朝下。待彈孢24 h后，自封袋收集硫酸紙密封，4 ℃保存備用。

用移液槍吸取少量無菌水在硫酸紙孢子印處吸打，制成擔孢子懸液，經梯度稀釋至10-3，每個梯度吸取100 μL擔孢子液涂布于抗性培養基上（100 μL氨芐西林/100 mL培養基），25 ℃暗培養。1周后待小菌落陸續出現即在顯微鏡下挑取新萌發菌絲或大菌落邊緣的尖端菌絲，轉接到PDA試管斜面培養基上。待菌絲長成一定大小的菌落后鏡檢，將無鎖狀聯合的菌株保藏備用。

1. 2. 3 原生質體單核化和標準測交菌株確定 轉接菌株Gr0001+3的菌絲于液體PDA培養基，25 ℃搖床培養7 d，以0.6 mol/mL甘露醇作滲透壓穩定劑，采用2%真菌溶壁酶于pH 5.5和30 ℃下酶解5 h（薛平海等，2004）。獲得原生質體后，于MYG再生培養基上涂布再生，25 ℃培養3 d，在顯微鏡下挑取剛萌發的原生質體并轉移至PDA斜面繼續培養。鏡檢觀察并選取單核化菌絲（無鎖狀聯合）保藏備用。

任取一株原生質體單核化菌株與余下所有菌株配對，凡能與該菌株配對形成鎖狀聯合的歸為一類，記為T1；凡不能與該菌株配對形成鎖狀聯合的歸為另一類，記為T2。指定T1的交配型為A1B1，T2的交配型為A2B2，T1、T2即為所需的標準測交菌株。

1. 2. 4 孢子單核體4類交配型確定 分別從T1和T2中任取一株菌株與所有孢子單核體菌株配對，凡能與T1菌株配對形成鎖狀聯合的菌株記為T2，能與T2菌株配對形成鎖狀聯合的菌株記為T1；從與T1、T2配對均不能形成鎖狀聯合的菌株中任取一株，與剩余菌株配對，凡能配對形成鎖狀聯合的菌株記為T3，不能形成鎖狀聯合的菌株記為T4。

1. 2. 5 OWE-SOJ技術應用 利用對峙培養，將4種交配型T1、T2、T3及T4菌株兩兩對峙接種于OWE培養基上，兩接種塊間相距約0.5 cm，25 ℃下對峙培養1周。當接種塊間菌絲接觸后，將兩接種塊沿配對區垂直方向整條切塊，并轉接至SOJ培養基上。25 ℃下培養10～15 d觀察菌落形態。出現無鎖狀聯合的絨毛狀菌落，則為A=B≠反應；出現無鎖狀聯合的柵欄型菌落，則為A≠B=反應。

1. 2. 6 核遷移試驗 從4組孢子單核菌株T1、T2、T3及T4中，每組取數個單核體進行核遷移試驗。第一次配對按T1×T3、T1×T4、T2×T3和T2×T4組合配對。兩配對菌塊間相距約2.0 cm，培養至菌絲接觸后，在配對塊外側各取一菌塊分別與相應單核體進行二次配對。以鏡檢觀察有無鎖狀聯合形成來判斷有無核遷移現象發生。凡二次配對產生鎖狀聯合，表明相應的第一次配對有核遷移發生，其交配反應為A=B≠；凡二次配對無鎖狀聯合產生，表明相應的第一次配對無核遷移發生，其交配反應為A≠B=。據此確定T1與T3間交配型關系是A=B≠或A≠B=；同理，可鑒定對應的T1與T4間、T2與T3間、T2與T4間的交配型關系。

2 結果與分析

2. 1 灰樹花菌株原生質體單核體鑒定及標準測交菌株T1、T2確定

對供試菌株Gr0001+3的菌絲進行原生質體單核化（圖1），在其萌發的不同時間點挑取再生原生質體，共獲得再生菌株35株，經鏡檢確認其中17株為單核體（表1）。將確認的17株單核體相互配對后獲得兩種交配型菌株，其中10株為T1型（即交配型為A1B1），7株為T2型（即交配型為A2B2）。

2. 2 灰樹花標準菌株T3、T4確定及孢子單核體交配型常規分析

收集菌株Gr0001+3的孢子并分離鑒定獲得71株單核體（圖2）。通過與標準測交菌株T1、T2分別配對發現，其中28株單核體為T1型，35株單核體為T2型，余下8株單核體菌株互配，4株為T3型，4株為T4型。將所有的單核體分為T1、T2、T3和T4 4種類型，其各自所占比例分別為39.4%、49.3%、5.6%和5.6%（表2）。

2. 3 4類孢子單核體菌株交配型的準確鑒定

2. 3. 1 OWE-SOJ技術與交配型的準確鑒定 從4種類型孢子單核體菌株中每組隨機取3株[T1（3、12、69），T2（5、24、37），T3（34、48、64），T4（16、56、79）]，通過OWE-SOJ技術進行6種組合配對（T1×T2，T3×T4，T1×T3，T2×T4，T2×T3，T1×T4），并觀察分析上述54個配對在SOJ培養基上的反應情況，結果出現3種特征反應（圖3）。由表3可知，在6種配對組合中，T1×T2和T3×T4的菌絲反應均為一致的“+”反應，進一步確認T1組與T2組、T3組與T4組均為A≠B≠；T1×T3以“F”反應占多數（8個“F”反應，1個不典型“F-”反應），T2×T4以“F”反應稍占優勢（5個“F”反應，4個不典型“F-”反應）；T2×T3以“B”反應占多數（7個“B”反應，2個不典型“B-”反應），T1×T4以“B”反應稍占優勢（5個“B”反應，4個不典型“B-”反應）。從反應結果可以看出一種趨勢，即T1×T3、T2×T4屬于“F”反應；T2×T3和T1×T4屬于“B”反應。

因此，在指定T1和T2的交配型分別為A1B1和A2B2的情況下，可推斷T3的交配型為A1B2、T4的交配型為A2B1。

2. 3. 2 核遷移試驗與交配型的準確鑒定 已指定T1（3、12、69）和T2（5、24、37）的交配型分別為A1B1和A2B2，經核遷移試驗，通過216組二次配對，發現第一次配對中T1與T4、T2與T3分別發生了核遷移，而T1與T3、T2與T4均未發生核遷移。若第一次配對有核遷移發生，其交配反應為A=B≠，若無核遷移發生，其交配反應為A≠B=。據此推測T3（34、48、64）、T4（16、56、79）的交配型分別為A2B1和A1B2。

2. 3. 3 交配型的鑒定結果 通過OWE-SOJ技術和核遷移試驗，發現兩種方法鑒定出的交配型不一致。OWE-SOJ技術鑒定T1、T2、T3及T4的交配型分別為A1B1、A2B2、A1B2和A2B1，而核遷移試驗鑒定T1、T2、T3和T4的交配型分別為A1B1、A2B2、A2B1和A1B2。鑒于核遷移試驗是常規鑒定方法，OWE-SOJ技術是一種輔助驗證手段，因此以核遷移試驗結果為準（表4）。

3 討論

本研究中灰樹花親本型單核體菌株T1和T2的數量占T1、T2、T3和T4 4種類型孢子單核體菌株總數的88.7%，可能與親本型孢子比非親本型孢子更易萌發或交配型因子發生了偏分離現象有關，此偏分離現象也存在于香菇（程水明和林范學，2007）和楊柳田頭菇（張小雷等，2012）等菇類中。

灰樹花菌株Gr0001+3的原生質體再生率較低，其原生質體單核化率僅48.57%，與潘迎捷等（1993）對異宗結合食用菌的研究結果基本相符。林芳燦和朱勤釗（1993）研究指出，原生質體的分離主要取決于細胞的生理狀態、裂解酶和滲透穩定劑；潘迎捷等（1993）研究指出，形成雙核體、單核體和無核體3種原生質體是造成原生質體再生率較低的主要原因；此外，挑取再生菌落的時機也很重要，一般雙核體萌發快于單核體。本研究也獲得了相似的結果。

OWE-SOJ技術已成功應用于蜜環菌（Darmonoet and Burdsall，1992）、香菇（林芳燦等，2000）和側耳（程莉等，2007）等食用菌的交配型鑒定，但本研究利用OWE-SOJ技術鑒定灰樹花交配型的結果與核遷移試驗鑒定結果不一致，說明OWE-SOJ技術不適用于灰樹花的交配型分析。原因可能與平菇、香菇菌落表觀形態（均呈絨毛狀）及菌落反應穩定而灰樹花菌落表觀形態（主要呈氈狀，絨毛少且絨毛狀不明顯）易受環境影響、菌落反應不穩定有關。OWE-SOJ技術是否適用于其他類型菌落形態菌類交配型判斷有待進一步探討。

核遷移試驗作為鑒定食用菌交配型的一種手段，是從微觀水平觀察鎖狀聯合并以此來推斷交配型，可靠性和穩定性高。Raudaskeski和Kothe（2010）及Heitman等（2013）研究認為，核遷移試驗是基于B因子的特定功能，在四極性異宗結合菌中只有A≠B≠或A=B≠，即B因子不相同的菌株配對才會發生核遷移，因此兩個交配反應同為不親和配對，根據二次配對有無鎖狀聯合即是否發生核遷移來區分A=B≠及A≠B=兩種類型。鑒于此，本研究利用核遷移試驗鑒定T1、T2、T3和T4交配型分別為A1B1、A2B2、A2B1和A1B2。

4 結論

本研究結果表明，灰樹花屬于四極性交配型系統，其交配型分析應以核遷移試驗為準，OWE-SOJ技術不適用于灰樹花的交配型分析。

參考文獻：

陳裕新，夏志蘭，劉鵬，康信聰，洪亞輝，劉東波. 2012. 靈芝群體交配基因型分析[J]. 農業科學與技術（英文版），13（8）：1651-1654.

Chen Y X，Xia Z L，Liu P，Kang X C，Hong Y H，Liu D B. 2012. Mating genotype analysis of Ganoderma lucidum populations[J]. Agricultural Biotechnology（English Edition），13（8）：1651-1654.

程莉，李安政，林范學，林芳燦. 2007. 糙皮側耳擔孢子交配型的鑒定[J]. 微生物學通報，34（6）：1086-1089.

Cheng L，Li A Z，Lin F X，Lin F C. 2007. Accurate determination of mating type of basidispores in Pleurotus ostreatus[J]. Microbiology，34（6）：1086-1089.

程水明，林范學. 2007. 香菇擔孢子交配型比例偏分離的遺傳分析[J]. 中國農業科學，40（10）：2296-2302.

Cheng S M，Lin F X. 2007. Genetic analysis of distorted segregation ratio of mating types among basidiospores in Lentinula edodes[J]. Scientia Agricultura Sinica，40（10）：2296-2302.

傅俊生，蔡衍山，柯麗娜，林紹霞，鄧優錦，謝寶貴. 2007. 金福菇的交配型研究[J]. 食用菌學報，14（3）：10-12.

Fu J S，Cai Y S，Ke L N，Lin S X，Deng Y J，Xie B G. 2007. Mating system of Tricholoma giganteum[J]. Acta Edulis Fungi，14（3）：10-12.

郭家瑞，王衛國，李磊，何泓良. 2010. 灰樹花研究概述[J]. 食用菌，（4）：1-2.

Guo J R，Wang W G，Li L，He H L. 2010. An outline for the research of Grifola frondosa[J]. Edible Fungi，（4）：1-2.

郭予斌，李洽勝，吳昭暉，姚開泰. 2011. 灰樹花化學成分和藥理作用的研究進展[J]. 藥物評價研究，34（4）：283-288.

Guo Y B，Li Q S，Wu Z H，Yao K T. 2011. Research advances on chemical constituents and pharmacological effect of Grifola frondosa[J]. Drug Evaluation Research，34（4）：283-288.

李安政，林芳燦. 2013. 核遷移試驗在香菇交配型分析中的應用[J]. 湖北民族學院學報（自然科學版），31（3）：289-291.

Li A Z，Lin F C. 2013. The mating type analysis in Lentinula edodes using nuclear migration test[J]. Journal of Hubei University for Nationalities（Natural Science Edition），31（3）：289-291.

李小定，榮建華，吳謀成. 2003. 灰樹花多糖藥理研究進展[J].天然產物研究與開發，15（4）：364-368.

Li X D，Rong J H，Wu M C. 2003. Recent pharmacological stu-

dies on polysaccharide from Grifola frondosa[J]. Natural Pro-

duct Research and Development，15（4）：364-368.

林芳燦，汪中文，熊再明，代江紅，閔家順. 2000. OWE-SOJ技術及核遷移試驗在香菇交配型因子鑒定中的應用[J]. 華中農業大學學報，19（6）：573-576.

Lin F C，Wang Z W，Xiong Z M，Dai J H，Min J S. 2000. Application of OWE-SOJ technique and Nuclear migration test in the determinatiion of mating type factors in Lentinula edodes[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，19（6）：573-576.

林芳燦，朱勤釗. 1993. 食用菌異宗結合種的原生質體單核化技術[J]. 中國食用菌雜志，12（5）：14-16.

Lin F C，Zhu Q Z. 1993. Monokaryogenesis technology of he-

terothallic edible mushroom species[J]. Edible Fungi of China，12（5）：14-16.

劉振偉，史秀娟. 2005. 灰樹花雜交良種的選育[J]. 山東農業科學，（1）：27-32.

Liu Z W，Shi X J. 2005. The crossbreeding of Grifola frondosa[J]. Shandong Agricultural Sciences，（1）：27-32.

潘迎捷，廖漢泉，張樹庭，尤美蓮，趙炯. 1993. 異宗結合食用菌的原生質體單核化[J]. 上海農業學報，9（2）：1-5.

Pan Y J，Liao H Q，Zhang S T，You M L，Zhao J. 1993. A study on monokaryotization by protoplasting of heterokaryotic mushrooms[J]. Acta Agriculturae Shanghai，9（2）：1-5.

汪虹，曹暉. 2006. 大球蓋菇交配系統的研究[J]. 食用菌學報，13（2）：9-11.

Wang H，Cao H. 2006. Mating system of Stropharia rugoso-annulata[J]. Acta Edulis Fungi，13（2）：9-11.

王帥，李杰. 2014. 灰樹花多糖抗腫瘤研究進展[J]. 中國保健營養，23（8）：211-212.

Wang S，Li J. 2014. Progress on the studies of antitumor efficacy of grifolan from Grifola frondosa[J]. China Health Care & Nutrition，23（8）：211-212.

徐錦堂. 1997. 中國藥用真菌學[M]. 北京：北京醫科大學，中國協和醫科大學聯合出版社.

Xu J T. 1997. Chinese Medical Mycology[M]. Beijing：Beijing Medical University，China Xiehe Medical University Joint Publishing House.

徐志祥，李剛，李寶健. 2004. 灰樹花紫外誘變育種研究[J]. 中山大學學報（自然科學版），43（2）：84-87.

Xu Z X，Li G，Li B J. 2004. UV induced mutagenesis of Grifola frondos[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sun Yat-seni（Natural Science Edition），43（2）：84-87.

薛平海，宮正，謝鯤鵬. 2004. 灰樹花原生質體制備與再生條件的研究[J]. 食用菌，26（1）：13-15.

Xue P H，Gong Z，Xie K P. 2004. The research on the preparation and regeneration of maitake protoplast[J]. Edible Fungi，26（1）：13-15.

尹清玉，李林輝. 2008. 雞腿菇交配型的初步研究[J]. 中國食用菌雜志，27（2）：13-15.

Yin Q Y，Li L H. 2008. Preliminary studies on mating system of Coprinus comatus[J]. Edible Fungi of China，27（2）：13-15.

張紅，曹暉，潘迎捷，曹娟云. 2002. 黑木耳交配型的研究[J]. 菌物系統，21（4）：559-564.

Zhang H，Cao H，Pan Y J，Cao J Y. 2002. Study on mating system of Auricularia auricula[J]. Mycosystema，21（4）：559-564.

張小雷，周會明，柴紅梅，李樹紅，田果廷，趙永昌. 2012. 楊柳田頭菇擔孢子交配型偏分離成因研究[J]. 西南農業學報，25（2）：609-613.

Zhang X L，Zhou H M，Chai H M，Li S H，Tian G T，Zhao Y C. 2012. Analysis of distorted segregation of mating types ratio of basidiospores in Agrocybe salicacola[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，25（2）：609-613.

朱小華，盧錦強，劉幼蘭，劉曦然，賈瑞博，艾超，林志誠，吳劍鋒. 2014. 灰樹花多糖的制備及其生物活性研究進展[J]. 中外食品，（6）：61-63.

Zhu X H，Lu J Q，Liu Y L，Liu X R，Jia R B，Ai C，Lin Z C，Wu J F. 2014. Research progress of preparation and bioactivity of polysaccharides of Grifola frondosa[J]. Global Food Industry，（6）：61-63.

Darmono T W，Burdsall H H. 1992. Morphological character of incompatibility reactions and evidence for nuclear migration in Armillaria mellea[J]. Mycologia，84（3）：367-375.

Heitman J，Sun S，James T Y. 2013. Evolution of fungal sexual reproduction[J]. Mycologia，105（1）：1-27.

Raudaskeski M，Kothe E. 2010. Basidiomycete mating type genes and pheromone signaling[J]. Eukaryotic Cell，9（6）：847-859.

（責任編輯 思利華）