微波協同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖工藝優化

劉源　楊剛　張孝琴　楊學武

摘要：【目的】優化微波協同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工藝條件，為提高虎掌菌多糖提取率提供新的工藝技術。【方法】以甘孜虎掌菌為試驗材料、多糖提取率為考察指標，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken中心組合設計及響應面法優化微波協同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工藝條件。【結果】影響微波協同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的因素順序為：復合酶用量>酶解溫度>微波功率>微波時間，復合酶用量和酶解溫度對多糖提取率的影響極顯著（P<0.01），酶解溫度與微波時間兩因素交互作用影響顯著（P<0.05），其最佳提取工藝條件為：纖維素酶與木瓜蛋白酶的復合酶質量比1∶1、復合酶用量0.70%、 pH 5.0、酶解溫度51 ℃、微波時間4.3 min、微波功率550 W，在此條件下的虎掌菌多糖提取率為16.09%，與模型預測值16.2537%的相對誤差為1.02%，誤差較小。【結論】建立的模型對甘孜虎掌菌多糖具有較好的預測作用，優化的工藝參數可用于實際生產。

關鍵詞： 虎掌菌；多糖；響應面法；微波協同復合酶法；甘孜

中圖分類號： S646.9 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0442-07

0 引言

【研究意義】虎掌菌（Sarcodon imbricatus）又稱獐子菌、翹鱗肉齒菌，其子實體中等至大型，表面有暗灰色至黑褐色大鱗片。中醫認為，虎掌菌性平味甘，具有追風散寒、降低膽固醇等作用，同時具有益氣補氣、治風破血、和胃通便、降血壓、解食物之毒、治頭痛頭昏等功效（趙雨霽和王琦，2014）。已有研究表明，虎掌菌多糖具有抗腫瘤、抗氧化及抑菌活性等作用（才媛，2013；丁祥等，2015）。虎掌菌主要分布于云南省楚雄州和麗江縣，目前對云南野生虎掌菌的研究較多（杜萍等，2010；王雪冰，2011）；但海拔3500 m以上的川西高原每年也出產此菌，據調查四川甘孜州的野生虎掌菌年生長量超300 t，其年產量與云南相當，也是我國虎掌菌的主產區之一（陳杭等，2014）。由于開發較晚，目前尚無甘孜虎掌菌的研究報道。因此，研究甘孜虎掌菌的多糖提取工藝，對真菌多糖的藥用開發具有重要意義。【前人研究進展】近年來，真菌多糖的提取已由傳統水提醇沉法轉為酶解法、超聲波和微波輔助提取。微波協同酶法提取真菌多糖，是利用酶對細胞壁的破壞，結合微波的高能，促使目標物進入溶劑，從而提高提取率。苗曉燕等（2012）利用微波協同纖維素與果膠酶的復合酶提取猴頭菌絲體多糖，在復合酶用量1%、pH 4.2、水浴溫度50 ℃、酶解時間30 min、微波功率500 W、微波時間3 min、料液比1∶50的條件下得到多糖提取率為8.01%；黃瓊和丁玲（2013）采用微波協同果膠酶提取金針菇多糖，得到提取率為21.76%，比單一微波法提取率提高了13.95%；汪振炯等（2014）對蛹蟲草菌絲體采用纖維素酶協同微波法提取，得到18.45%的蛹蟲草基質多糖。關于云南虎掌菌多糖提取工藝的研究也有一些文獻報道，王雪冰（2011）采用水提、酸堿浸提、酶解、超聲波、微波、超臨界萃取等6個單一工藝提取云南虎掌菌多糖，并比較不同方法在多糖提取工藝中的利弊；之后，王雪冰等（2011）采用響應曲面法優化水法提取云南野生虎掌菌多糖的工藝條件，得出最佳提取工藝條件為：提取時間3.25 h、提取溫度94 ℃、水料比45.5∶1，在此條件下，虎掌菌多糖提取率為9.14%；韋丁（2011）利用熱水回流提取法得到黑虎掌菌多糖提取率為2.29%。【本研究切入點】目前關于微波協同復合酶法提取虎掌菌多糖的研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】以甘孜虎掌菌為試驗材料，以多糖提取率為考察指標，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken中心組合設計及響應面法優化微波協同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工藝條件，為提高虎掌菌多糖提取率提供新的工藝技術。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

虎掌菌采自四川省甘孜州稻城縣色拉鄉，經清水洗凈后晾干、粉碎，過50目篩備用。纖維素酶（酶活單位≥50 U/mg，最適溫度30～60 ℃，最適pH 4.0～6.5）購自江蘇銳陽生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活單位≥100 U/mg，最適溫度50～60 ℃，最適pH 5.0～7.5）購自南寧東恒華道生物科技有限責任公司；葡萄糖、硫酸、苯酚、丙酮、乙醚、無水乙醇等試劑均為國產分析純。主要儀器設備：RE52CS-1旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、MCR-3S微波爐（西安予輝儀器有限公司）、SP-1901型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、FW80-1粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州智博瑞儀器制造有限公司）。

1. 2 多糖提取工藝流程

準確稱取甘孜虎掌菌子實體干粉→添加一定量復合酶→加入50%乙醇溶解→調節pH→控制酶解溫度→進行微波處理→水浴鍋酶解1 h→90 ℃滅酶30 min→抽濾→定容→計算提取率。

1. 3 提取工藝最佳參數確定

在單因素試驗中，以分析純葡萄糖為對照，依次改變不同酶的質量比、復合酶用量、微波時間、微波功率、pH、酶解溫度，以虎掌菌多糖提取率為考察指標進行分析。結合實際工藝過程的條件，確定最佳參數再進行響應面分析設計試驗。

1. 4 多糖提取率測定

以葡萄糖質量濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準工作曲線，得回歸方程：y=0.00631x-0.028（R=

0.9992）。

多糖提取率（%）=提取得到的多糖質量/原料總質量×100

1. 5 統計分析

采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 不同酶質量比對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波時間3.0 min、微波功率600 W的條件下，分別添加酶總用量為0.5%的纖維素酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶與木瓜蛋白酶組成的復合酶（質量比1∶2、1∶1、2∶1），結果見圖1。復合酶的甘孜虎掌菌多糖提取率均高于單一酶的多糖提取率，且以復合酶質量比為1∶1的多糖提取率最高（15.42%），顯著高于單一酶的多糖提取率（P<0.05，下同），但單一酶的多糖提取率與復合酶質量比為1∶2和2∶1的多糖提取率間無顯著差異（P>0.05，下同）。最終選擇纖維素酶與木瓜蛋白酶以質量比1∶1組成的復合酶進行后續試驗。

2. 1. 2 復合酶用量對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波時間3.0 min、微波功率600 W的條件下，分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的復合酶，結果見圖2。隨著復合酶用量的增加，甘孜虎掌菌多糖提取率逐漸升高，復合酶用量為0.6%時達最大值，顯著高于復合酶用量0.2%和0.4%的提取率；繼續增加復合酶用量，多糖提取率有所下降，但用量在0.6%～1.0%的提取率間無顯著差異。最終選擇0.4%、0.6%、0.8%的復合酶用量進行響應面試驗。

2. 1. 3 酶解溫度對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復合酶用量0.5%、pH 5.5、微波時間3.0 min、微波功率600 W的條件下，設置不同酶解溫度分別為35、40、45、50、55和60 ℃，結果見圖3。甘孜虎掌菌多糖提取率隨著酶解溫度的升高而逐漸增大，當酶解溫度為50 ℃時達最大值，40～60 ℃的多糖提取率無顯著差異，但在50 ℃后呈下降趨勢。最終選擇酶解溫度45、50、55 ℃進行響應面試驗。

2. 1. 4 微波時間對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復合酶用量0.5%、pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波功率600 W的條件下，設置不同微波時間分別為1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 min，結果見圖4。甘孜虎掌菌多糖提取率隨著微波時間的延長而逐漸升高，當微波時間超過3.0 min后，多糖提取率間無顯著性差異，4.0 min后提取率略有下降。最終選擇微波時間3.0、4.0、5.0 min進行響應面試驗。

2. 1. 5 微波功率對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復合酶用量0.5%、pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波時間3.0 min的條件下，設置不同微波功率分別為500、550、600、650和700 W，結果見圖5。甘孜虎掌菌多糖提取率隨著微波功率的增大逐漸升高，當微波功率為550 W時達最大值，除與600 W間無顯著性差異外，與其他微波功率均有顯著性差異，超過550 W后，多糖提取率快速下降。最終選擇微波功率500、550、600 W進行響應面試驗。

2. 1. 6 pH對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復合酶用量0.5%、酶解溫度50 ℃、微波功率600 W、微波時間3.0 min的條件下，設置不同pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，結果見圖6。甘孜虎掌菌多糖提取率在酸性較大的情況下（pH 4.0～4.5）有顯著性差異，但隨著pH的增加，在4.5～7.0范圍內無顯著變化，因此選擇pH 5.0（提取率為最大值）進行響應面試驗。

2. 2 響應面法優化甘孜虎掌菌多糖提取工藝

2. 2. 1 響應面法試驗結果 結合上述單因素試驗結果，根據Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken中心組合試驗設計原理，確定纖維素酶與木瓜蛋白酶的復合酶質量比1∶1、pH 5.0，以復合酶用量、酶解溫度、微波時間和微波功率為主要因素，設計4因素3水平響應面分析試驗，試驗因素水平編碼見表1。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面試驗結果（表2）進行多元回歸擬合分析，得到模型的擬合曲線方程為：Y=15.78+1.29A+0.76B+0.21C-0.46D-0.27AB+

0.13AC+0.022AD+1.06BC-0.44BD-0.47CD-1.32A2-

1.85B2-1.04C2-2.38D2。

對模型的回歸系數和方差分析結果進行顯著性檢驗，由表3可知，該模型的P=0.0001<0.05，表明該模型的回歸方程具有顯著性。各因素對甘孜虎掌菌多糖提取率影響排序為：A>B>D>C，其中，交互項BC作用顯著，一次項A、B和二次項A2、B2、C2、D2作用極顯著（P<0.01）。在P<0.05顯著水平下剔除不顯著項后，對模型式進行優化，其結果為：Y=15.78+1.29A+0.76B+ 1.06BC-1.32A2-1.85B2-1.04C2-2.38D2。

2. 2. 2 響應面分析因素間的交互作用 根據擬合回歸方程，繪制兩個交互項的響應面圖（圖7），以考察其對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響。響應曲面坡度較平滑，說明響應值受各變量變化的影響較小；反之，響應曲面坡度較陡峭，則說明響應值受變量交互作用較為明顯。由圖7可知，酶解溫度與微波時間之間存在顯著的交互作用，而復合酶用量與酶解時間、微波時間、微波功率之間的交互作用，以及酶解溫度與微波功率、微波時間與微波功率間的交互作用不顯著，與響應面方差分析結果相一致。

2. 2. 3 最佳提取條件的確定和驗證 利用Design- Expert 8.0.6軟件得到優化的提取工藝為：復合酶用量0.69%、酶解溫度51.37 ℃、微波時間4.30 min、微波功率542.57 W，在此條件下甘孜虎掌菌多糖提取率的預測值為16.2537%。綜合考慮多糖提取率和試驗可操作性等因素，修正最佳工藝條件為：纖維素酶與木瓜蛋白酶的復合酶質量比1∶1、復合酶用量0.70%、pH 5.0、酶解溫度51 ℃、微波時間4.3 min、微波功率550 W，在此條件下進行驗證，實際測定值為16.09%，相對誤差為1.02%。表明該模型推測得到的最佳工藝參數對實際的預測較可靠，有一定指導意義。

3 討論

目前，關于云南虎掌菌的多糖提取多采用單一工藝完成。王雪冰（2011）采用水提醇沉法提取云南黑虎掌菌多糖的提取率為9.01%，采用微波輔助提取多糖的提取率為16.92%；韋丁（2011）利用熱水回流提取黑虎掌菌多糖的提取率為為2.29%。比較發現水提醇沉法耗時多，提取率低；單一微波法的提取率較高，但易破壞活性成分。微波協同復合酶法提取真菌多糖，選擇適宜的復合酶配比，使植物細胞壁降解，讓多糖成分充分釋放，從而提高提取率，目前此法已廣泛應用于真菌多糖的提取（朱彩平和肖智敏，2011；苗曉燕等，2012；黃瓊和丁玲，2013）。本研究采用微波協同復合酶法從甘孜野生虎掌菌中提取多糖，通過6個單因素考察試驗，結合Box-Behnken中心組合設計建立了4因素3水平試驗模型，在優化的工藝條件下得到多糖提取率為16.09%，較采用水提醇沉法（王雪冰，2011）、熱水回流法（韋丁，2011）的提取率高，也高于同屬野生竹蓀菌托（吳雪艷等，2015）和青頭菌（王靜等，2015）的多糖提取率。可見，甘孜虎掌菌多糖含量較高，采用微波協同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖可有效提高提取率。

在本研究中，單因素和兩因素交互作用對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響表現為：復合酶用量>酶解溫度>微波功率>微波時間，其中復合酶用量和酶解溫度對多糖提取率的影響極顯著，酶解溫度與微波時間兩因素交互作用影響顯著，與黃瓊和丁玲（2013）的研究結果一致。在微波協同復合酶法提取多糖的工藝中，還存在其他影響因素，如料液比、酶解時間、提取次數、其他生物酶的選擇等，下一步將綜合考察這些因素，得出更優的提取方案，以期獲得更高的提取率。

4 結論

本研究通過響應面法優化微波協同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖工藝，得到最佳提取工藝條件為：纖維素酶與木瓜蛋白酶的復合酶質量比1∶1、復合酶用量0.70%、 pH 5.0、酶解溫度51 ℃、微波時間4.3 min、微波功率550 W，在此條件下的多糖提取率為16.09%，與模型預測值16.2537%的相對誤差為1.02%。表明建立的模型對甘孜虎掌菌多糖具有較好的預測作用，優化的工藝參數可用于實際生產。

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（責任編輯 羅 麗）