二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化復(fù)合酶法提取甘蔗梢多酚工藝

張思原　黃慧玲　周永升　李玉銘　陸海勤

摘要：【目的】利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化復(fù)合酶法提取甘蔗梢多酚工藝條件，為甘蔗梢的綜合利用提供技術(shù)參考。【方法】以粵糖159號蔗梢為試驗原料，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以甘蔗梢多酚提取量為考察指標(biāo)，選擇復(fù)合酶用量、pH、提取溫度、提取時間為試驗因素，采用4因子二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計（1/2實施）對甘蔗梢多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定復(fù)合酶法最佳工藝條件。【結(jié)果】建立甘蔗梢多酚提取量（Y）對復(fù)合酶用量（X1）、pH（X2）、提取溫度（X3）及提取時間（X4）4個試驗因素的二次正交回歸模型：Y=4.51155+0.16908X1+0.20925X3-0.14736X32，該模型擬合性較好，其中復(fù)合酶用量和提取溫度對甘蔗梢多酚提取量有極顯著影響（P<0.01）。復(fù)合酶法提取甘蔗梢多酚的最佳工藝條件為：在復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3）用量1.6%、pH 5.0、提取溫度56 ℃的條件下提取30 min，甘蔗梢多酚提取量的模型預(yù)測值為4.86 mg/g，重復(fù)3次試驗的驗證值為4.71 mg/g；通過檢驗分析，顯著性水平為0.01時，驗證值與預(yù)測值一致。【結(jié)論】采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化得到的復(fù)合酶法提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，有效提高了甘蔗梢多酚提取效率，可在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 多酚；甘蔗梢；復(fù)合酶法；正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計；工藝優(yōu)化

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0459-07

0 引言

【研究意義】甘蔗梢又名甘蔗尾葉，包括甘蔗頂?shù)淖钅酃?jié)及青綠葉片，約占甘蔗產(chǎn)量的20%，是甘蔗生產(chǎn)過程的主要副產(chǎn)物之一。廣西是我國甘蔗生產(chǎn)第一大省，年產(chǎn)量約7000萬t，甘蔗梢可達(dá)1000萬t以上，目前主要用于動物飼料或焚燒（張艷蘭，2008；孫健等，2013）。甘蔗梢富含多酚類化合物，約占整條甘蔗的37%，而蔗葉占33%，去梢后的蔗莖占30%（de Souza- Sartori et al.，2013）。植物多酚有多種生物活性，在醫(yī)藥方面可利用多酚的抗氧化、抗病毒等活性制備疫苗，或作為延緩衰老及抗病毒等藥物（扶雄等，2003；金瑩和孫愛東，2005）。因此，研究甘蔗梢多酚的提取工藝，對其合理開發(fā)與利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，關(guān)于甘蔗梢中有效成分的提取工藝研究已有不少文獻(xiàn)報道。孫曉雪（2007）采用乙醇溶劑浸提法提取甘蔗梢多酚，通過正交試驗確定最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、固液比1∶4（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取時間2 h，甘蔗梢多酚提取量為185 mg/100 g。蘇杏嚴(yán)等（2011）利用微波輔助提取甘蔗梢中黃酮類多酚化合物，確定最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取時間50 min，在此條件下的提取率為0.255%。李新瑩等（2014）采用響應(yīng)面法對超聲波輔助提取甘蔗梢中抗氧化活性成分的工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取工藝為：在乙醇體積分?jǐn)?shù)63.79%、料液比1∶14.34（g/mL）、25 ℃條件下超聲提取3次，每次1.43 h，提取率為2.86 mg/g。何雪梅等（2015）采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取甘蔗梢多酚工藝，確定最佳提取條件為：在乙醇體積分?jǐn)?shù)51%、超聲功率720 W、70 ℃下提取90 min，甘蔗梢多酚提取量為4.649 mg/g。【本研究切入點】生物酶法具有反應(yīng)條件溫和、提取時間短、耗能低等優(yōu)點，近年來已廣泛應(yīng)用于植物多酚物質(zhì)的提取（付曉燕等，2012；程雅芳等，2012；龔玉雷，2013），但目前尚無利用此法提取甘蔗梢多酚的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以甘蔗梢為試驗原料、甘蔗梢多酚提取量為考察指標(biāo)，通過單因素試驗和二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，對復(fù)合酶法提取甘蔗梢多酚的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件，為甘蔗梢的綜合利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為粵糖159號蔗梢，采自廣西南寧市吳圩區(qū)蔗田，干燥后粉碎過80目篩，冷藏備用。果膠酶（≥50.0 U/g）、纖維素酶（≥15000.0 U/g）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，福林酚試劑購自北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（>98%）、無水乙醇、無水碳酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸等均為分析純。主要儀器設(shè)備有：722N紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）、SHZ-82A水浴恒溫振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠）、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、SHB-III T循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、FW135粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、電子分析天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]。

1. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取0.05 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入去離子水完全溶解，定容于500 mL容量瓶，配制成0.1 mg/mL沒食子酸溶液；準(zhǔn)確吸取沒食子酸溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL分別置于100 mL容量瓶中，配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8 mg/L不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；然后分別加入2.0 mL福林酚試劑、3.0 mL 10%碳酸鈉溶液，充分混勻，用蒸餾水定容至100 mL，27 ℃下反應(yīng)30 min，于769 nm處測定其吸光值。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0978x+ 0.0228，R2=0.9946。

1. 3 甘蔗梢多酚提取量計算

吸取2.0 mL甘蔗梢提取液置于100 mL容量瓶中，加入2.0 mL福林酚試劑和3.0 mL 10%碳酸鈉溶液，充分混勻，用蒸餾水定容至100 mL，27 ℃下反應(yīng)30 min，于769 nm處測定吸光值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算對應(yīng)的甘蔗梢多酚質(zhì)量濃度，再根據(jù)下式計算多酚提取量：

多酚提取量（mg/g）=C×V×K/W×10-3

式中，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出的甘蔗梢多酚質(zhì)量濃度（mg/L），V為提取液體積（mL），K為稀釋倍數(shù)，W為甘蔗梢質(zhì)量（g）。

1. 4 單因素試驗

1. 4. 1 酶種類對甘蔗梢多酚提取量的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g甘蔗梢粉末5份，按料液比1∶20加入pH 5.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，再分別加入酶總用量為1.0%（以酶/底物質(zhì)量×100計，下同）的5種酶解體系[果膠酶（種類1）；纖維素酶（種類2）；果膠酶與纖維素酶合成復(fù)合酶（種類3）；果膠酶、纖維素酶及木瓜蛋白酶合成復(fù)合酶（種類4）；木瓜蛋白酶（種類5）]，50 ℃下反應(yīng)50 min后，85 ℃水浴滅酶，然后真空抽濾、收集濾液、定容，計算甘蔗梢多酚提取量。

1. 4. 2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對甘蔗梢多酚提取量的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20加入pH 5.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，再分別加入果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3的1.0%復(fù)合酶，50 ℃下反應(yīng)50 min后，85 ℃水浴滅酶，然后真空抽濾、收集濾液、定容，計算甘蔗梢多酚提取量。

1. 4. 3 復(fù)合酶用量對甘蔗梢多酚提取量的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20加入pH 5.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，再分別加入0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3），50 ℃下反應(yīng)50 min后，85 ℃水浴滅酶，然后真空抽濾、收集濾液、定容，計算甘蔗梢多酚提取量。

1. 4. 4 pH對甘蔗梢多酚提取量的影響 分別準(zhǔn)確稱取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20分別加入pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，再加入1.0%復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3），50 ℃下反應(yīng)50 min后，85 ℃水浴滅酶，然后真空抽濾、收集濾液、定容，計算甘蔗梢多酚提取量。

1. 4. 5 提取溫度對甘蔗梢多酚提取量的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20分別加入pH 5.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，再加入1.0%復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3），分別于30、40、50、60、70、80 ℃下反應(yīng)50 min后，85 ℃水浴滅酶，然后真空抽濾、收集濾液、定容，計算甘蔗梢多酚提取量。

1. 4 .6 提取時間對甘蔗梢多酚提取量的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20分別加入pH 5.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，再加入1.0%復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶=2∶3），50 ℃下分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min后，85 ℃水浴滅酶，然后真空抽濾、收集濾液、定容，計算甘蔗梢多酚提取量。

1. 5 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以甘蔗梢多酚提取量為考察指標(biāo)，以復(fù)合酶用量、pH、提取溫度、提取時間為試驗因素，采用4因子二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計（1/2實施）對甘蔗梢多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗因素與水平見表1。

1. 6 統(tǒng)計分析

采用Origin 7.0軟件對單因素試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，再利用DPS 7.05軟件對正交試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗結(jié)果

2. 1. 1 酶種類對甘蔗梢多酚提取量的影響 如圖2所示，5種酶解體系得到的甘蔗梢多酚提取量差異明顯，復(fù)合酶的多酚提取量高于單一酶。以種類3（果膠酶與纖維素酶結(jié)合）的甘蔗梢多酚提取量最高（4.27 mg/g），其次為種類4，即果膠酶、纖維素酶及木瓜蛋白酶結(jié)合，甘蔗梢多酚提取量為3.75 mg/g。種類4的甘蔗梢多酚提取量低于種類3，說明木瓜蛋白酶的存在會抑制果膠酶與纖維素酶的作用，因此，選擇果膠酶與纖維素酶混合的復(fù)合酶提取甘蔗梢多酚。

2. 1. 2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對甘蔗梢多酚提取量的影響 由圖3可知，復(fù)合酶中果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比不同，甘蔗梢多酚提取量有明顯差異。隨著復(fù)合酶中纖維素酶含量的不斷增多，甘蔗梢多酚提取量逐漸提高，因為細(xì)胞壁中纖維素含量較高，提高纖維素酶量能使細(xì)胞壁破裂更徹底，從而促使多酚溶出；當(dāng)果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為2∶3時，兩種酶發(fā)揮最大活性，甘蔗梢多酚提取量達(dá)最大值（3.71 mg/g），質(zhì)量比小于2∶3時，多酚提取量反而降低，說明復(fù)合酶對底物濃度已達(dá)到飽和，復(fù)合酶的作用受到抑制。因此，復(fù)合酶中果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比以2∶3為宜。

2. 1. 3 復(fù)合酶用量對甘蔗梢多酚提取量的影響 從圖4可以看出，復(fù)合酶用量在0.4%～1.6%時，隨著復(fù)合酶用量逐漸增加，甘蔗梢多酚提取量不斷升高，當(dāng)復(fù)合酶用量為1.6%時，提取量達(dá)最大值（4.35 mg/g），繼續(xù)增加復(fù)合酶用量，多酚提取量基本保持不變。這是因為底物濃度不變時，添加復(fù)合酶至一定值，會與底物達(dá)到飽和狀態(tài)；繼續(xù)添加復(fù)合酶會導(dǎo)致底物濃度不能對復(fù)合酶達(dá)到飽和，反而抑制復(fù)合酶的酶解作用。

2. 1. 4 pH對甘蔗梢多酚提取量的影響 由圖5可知，在其他條件保持不變的情況下，pH對甘蔗梢多酚提取量影響明顯，當(dāng)pH為4.0～5.0時，甘蔗梢多酚提取量基本保持不變，pH超過5.0后，甘蔗梢多酚提取量快速下降，因為不同種類的酶均有最適pH，與最適pH偏離大，會致使酶自身變性；與最適pH偏離范圍小，雖然酶不變性，但也會使酶活性部位發(fā)生改變，從而降低酶活力。說明pH在5.0左右有利于復(fù)合酶發(fā)揮最大活性；pH過高，酶活性會下降，不利于酶解作用；pH過低，不能發(fā)揮酶的最大活性。

2. 1. 5 提取溫度對甘蔗梢多酚提取量的影響 圖6顯示，固定其他條件不變，不同提取溫度對甘蔗梢多酚提取量影響明顯，說明不同種類的酶有最適溫度，偏離最適溫度會影響多酚提取量。開始階段，隨著提取溫度的逐漸升高，甘蔗梢多酚提取量不斷增加，當(dāng)提取溫度為50～60 ℃時，復(fù)合酶發(fā)揮最大活性與穩(wěn)定性，最大程度使細(xì)胞壁破裂，更多的溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，此溫度下的甘蔗梢多酚提取量最高，即為果膠酶與纖維素酶結(jié)合提取甘蔗梢多酚的最適溫度；溫度繼續(xù)升高，酶蛋白質(zhì)變性，酶活性下降，提取量也有所降低。因此，選擇最適的提取溫度為50 ℃。

2. 1. 6 提取時間對甘蔗梢多酚提取量的影響 由圖7可知，在10～40 min范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，甘蔗梢多酚提取量不斷增加，提取時間在40～50 min時，甘蔗梢多酚提取量基本無變化；超過50 min后，甘蔗梢多酚提取量緩慢降低。說明提取時間太短，酶解不充分，甘蔗梢多酚不能充分溶出，而延長時間對甘蔗梢多酚提取量的提高意義不大。因此，綜合考慮，選擇最佳的提取時間為40 min。

2. 2 回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計確定甘蔗梢多酚的最佳提取工藝

2. 2. 1 回歸方程建立 利用DPS 7.05軟件對二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果（表2）進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到復(fù)合酶用量（X1）、pH（X2）、提取溫度（X3）、提取時間（X4）4個因素與甘蔗梢多酚提取量（Y）之間的二次回歸方程：Y=4.51155+0.16908X1+0.00682X2+0.20925X3-0.07099X4+0.01350X12-0.07665X22-0.14736X32-0.02715X42+

0.09X1X2-0.0525X1X3+0.095X1X4+0.095X2X3-0.0525X2X4+

0.09X3X4。

由于設(shè)計具有正交性，各回歸系數(shù)之間無相關(guān)性，因此可根據(jù)方差分析結(jié)果（表3）直接剔除模型中的不顯著項建立回歸方程。簡化的二次正交回歸方程為：Y=4.51155+0.16908X1+0.20925X3-0.14736X32。

2. 2. 2 回歸模型顯著性檢驗 為檢驗回歸方程的可靠性，按照顯著性條件進(jìn)行檢驗。由表3可知，回歸項P2=0.01406<0.05，回歸項在0.05水平上顯著，說明方程與試驗數(shù)據(jù)的配合可行，可以建立回歸模型；失擬項P1=0.09011>0.05，失擬項不顯著，說明回歸模型與實際情況擬合好；F3=回歸平方和/誤差平方和=19.4814>F0.01=7.6049，達(dá)極顯著水平，因此，對于各試驗因素，方程回歸結(jié)果具有可靠性。

2. 3 效應(yīng)分析

2. 3. 1 主效應(yīng)分析 P可以反映各因素對試驗指標(biāo)的影響程度，P越小，表明該因素對試驗結(jié)果影響越大。由表3中各因素的P可知，4個試驗因素對甘蔗梢多酚提取量的影響排序為提取溫度（X3）>復(fù)合酶用量（X1）>提取時間（X4）>pH（X2）。

2. 3. 2 單效應(yīng)分析 用“降維法”將任意3個因素固定在零水平，得到另一個因素與甘蔗梢多酚提取量的效應(yīng)方程分別為：Y1=4.51155+0.16908X1+0.01350X12；Y2=

4.51155+0.00682X2-0.07665X22；Y3=4.51155+0.20925X3-

0.14736X32；Y4=4.51155-0.07099X4-0.02715X42。

由圖8可看出，復(fù)合酶用量與甘蔗梢多酚提取量的關(guān)系接近線性，說明復(fù)合酶用量作用顯著，隨著復(fù)合酶用量的增加，多酚提取量不斷增加。pH、提取溫度、提取時間與甘蔗梢多酚提取量均成開口向下的拋物線關(guān)系，說明這3個因素均存在一個合理的范圍，即對甘蔗梢多酚提取量影響均呈先上升后下降的變化趨勢。這與單因素試驗結(jié)果相吻合。

2. 3. 3 甘蔗梢多酚提取最優(yōu)方案及驗證結(jié)果 采用DPS 7.05軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，得出復(fù)合酶法提取甘蔗梢多酚的最優(yōu)方案為：復(fù)合酶用量在1.682水平（1.6%）、pH在0水平（5.0）、提取溫度在1水平（56 ℃）、提取時間在-1.682水平（30 min），此時甘蔗梢多酚提取量為4.86 mg/g。在此條件下重復(fù)3次試驗進(jìn)行驗證，甘蔗梢多酚提取量的平均值為4.71 mg/g，用t檢驗法進(jìn)行檢驗，在顯著性水平α=0.01時，t=-1.85，因t<0，|t|=1.850.01；|t|=1.85

4 結(jié)論

采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化得到的復(fù)合酶法提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，有效提高了甘蔗梢多酚提取效率，可在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）