O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表達與純化鑒定

何奇松　陳磊　顏健華　許瑞勝　易春華　韋達有　馮淑萍　黃勝斌　梁晟　熊毅

摘要：【目的】通過原核表達并純化獲得O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因及其多表位基因的重組蛋白，為建立O型FMDV抗體ELISA檢測試劑盒及制備動物高免血清提供技術支持。【方法】以O型FMDV VP1全基因重組質粒pMD18-T-T-VP1及串聯的VP1多表位基因重組質粒pMD18-T-O-VP1為模板，通過特異性引物擴增并回收目的基因，構建重組質粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1，然后轉入大腸桿菌BL211（DE3）中誘導表達，并以SDS-PAGE和Western blotting對融合蛋白進行分析鑒定。【結果】O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大腸桿菌BL21（DE3）中得到正確表達，表達的兩種融合蛋白主要以包涵體形式存在，純度較高，且均能與豬抗O型FMDV陽性血清發生特異性結合，具有良好的反應原性。【結論】表達獲得的融合蛋白具有良好的反應原性，可作為包被抗原應用于O型FMDV抗體檢測試劑盒研發。

關鍵詞： O型FMDV；VP1基因；多表位基因；原核表達；純化；鑒定

中圖分類號： S852.659.6 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0472-06

0 引言

【研究意義】口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）已被列為A類動物傳染病，是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一種高度接觸性傳染病（Sobrino et al.，2001；顏健華等，2015）。FMDV可感染多種偶蹄動物，傳播迅速，感染率高，一旦暴發將造成重大的經濟損失，許多國家高度重視對該病的研究。自2010年起，我國及周邊國家相繼發生O型FMD疫情（何繼軍等，2015），且與A型、Asia1型呈交替流行趨勢，涉及面廣、破壞性強（劉暢等，2013）。因此，加強FMD疫情監測及預警預報，對有效防控FMD及促進我國畜牧業健康發展具有重要意義。【前人研究進展】組成FMDV衣殼的主要結構蛋白有4種，分別為VP1、VP2、VP3和VP4（Collen et al.，1991）。FMDV的抗原區域主要位于結構蛋白VP1的第141～160位和第200～213位氨基酸殘基，可誘導動物機體產生中和抗體，同時也是抗原性的高變區（Mateu et al.，1996；柳紀省，1999）。因此，研究分析FMDV主要抗原區域的高變區不僅對揭示病毒遺傳變異機理具有重要意義，還能為FMD流行病學研究及新型疫苗研制提供參考依據。目前，我國已有研究以VP1蛋白的第21～40位及第141～160位基因片段與β-半乳糖甘基因構建重組表達載體（楊志軍等，2000），或將豬重鏈恒定區作為抗原載體的DNA疫苗（李金光等，2001），經相關動物試驗證實免疫效果良好。梁特等（2013）、解銀麗等（2015）采用桿狀病毒表達系統成功構建并表達了O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒，為O型FMDV疫苗的研究奠定了基礎。特尼格爾等（2015）研制的多型FMDV VP1表位融合蛋白與O型、A型和Asia1型FMDV陽性血清均能特異性結合，為VP1表位肽的免疫原性研究提供了參考。【本研究切入點】鑒于O型FMDV近年來的流行趨勢及FMDV抗原結構的復雜性，且不同血清型、基因型和分離株間的抗原位點及抗原表位均存在差別，因此有必要針對O型FMDV的VP1基因及其主要的抗原表位進行深入研究，為今后有效防控O型FMD提供參考。【擬解決的關鍵問題】采用原核表達系統對O型FMDV VP1基因及串聯的VP1多表位基因進行表達，對表達所得的兩種目的蛋白進行鑒定，分析其特異性及反應原性，以期為建立針對O型FMDV的競爭ELISA檢測方法及制備動物高免血清提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

O型FMDV VP1全基因重組質粒pMD18-T-T-VP1及串聯的VP1多表位基因重組質粒pMD18-T-O-VP1由廣西動物疫病預防控制中心家畜疫病診斷實驗室保存提供；DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素（Amp）貯存液、大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞、小量質粒提取試劑盒等購自天跟生化科技（北京）有限公司；EcoR I和Xho I限制性內切酶、膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、IPTG等購自寶生物工程（大連）有限公司；豬抗O型FMDV陽性血清購自中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗豚鼠IgG抗體、低分子量蛋白質Marker購自北京博奧森生物技術有限公司。

1. 2 引物設計與合成

根據原核表達載體（pET-32a和pGEX-6p-1）的酶切位點、FMDV VP1基因開放閱讀框及其串聯后VP1多表位基因，運用Oligo 6.0軟件設計2對表達引物（表1）。每條上游引物的5'端均添加EcoR I酶切位點（下劃線部分），下游引物的5'端均添加Xho I酶切位點（下劃線部分）。引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 原核重組表達載體構建

以重組質粒pMD18-T-T-VP1和pMD18-T-O-VP1為模板，用特異性引物VP1/VP2、O1/O2擴增并回收目的基因。采用EcoR I和Xho I進行雙酶切，并用同樣的酶切處理原核表達載體pET-32a和pGEX-6p-1，分別將擴增獲得的目的基因酶切回收產物與表達載體的酶切回收產物進行連接，然后轉化BL21（DE3）感受態細胞，提取重組質粒后，對陽性重組質粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1進行鑒定。

1. 4 誘導表達重組菌

對陽性重組質粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的菌液進行復蘇，于37 ℃下搖床（180 r/min）過夜培養。將復蘇菌液加入到含Amp的LB培養液中，37 ℃下斜搖（200 r/min）培養，待菌液OD值達0.4～0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導表達，分別在重組菌誘導前和誘導后1、2、3、4和5 h取樣，離心收集菌體后，通過SDS-PAGE分析重組蛋白的表達情況，再采用掃描的方法分析重組蛋白在菌體中的具體含量。

1. 5 重組表達菌表達形式確定

在最佳誘導表達條件下，取誘導表達后的菌液50 mL，10000×g離心10 min，棄上清液；用PBS洗滌重組菌沉淀，重復洗滌3次；加入30 mL PBS重懸重組菌沉淀，反復凍融3次后，在冰浴中超聲波裂解40 min；離心后分別收集裂解的沉淀和上清液，通過SDS-PAGE分析表達目的蛋白的表達形式。

1. 6 重組蛋白純化

重組蛋白pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1均采用柱層析純化方法進行純化，其純化步驟按照試劑盒說明進行操作，然后采用SDS-PAGE分析兩個重組蛋白的純化效果。

1. 7 Western blotting鑒定

將已純化好的重組蛋白PET-32a-VP1和pGEX- 6P-1-VP1進行SDS-PAGE分析，目的蛋白通過蛋白轉膜儀轉移到硝酸纖維素（NC）膜上，然后參照汪家政和范明（2000）的方法進行Western blotting鑒定。

2 結果與分析

2. 1 原核重組表達載體

采用特異性表達引物VP1/VP2擴增得到完整的VP1基因，大小為639 bp（圖1）；采用特異性表達引物O1/O2擴增得到含VP1主要抗原位點基因片段，大小為384 bp（圖2），兩個目的片段均與預期結果一致。將兩個目的片段分別克隆至原核表達載體pET-32a和pGEX-6p-1，經PCR和雙酶切鑒定，結果顯示重組質粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的目的片段與預期結果一致（圖3和圖4）。

2. 2 重組菌的融合表達及SDS-PAGE分析結果

重組菌pET-32a-VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/BL21分別于誘導前和誘導后1、2、3、4和5 h取樣， SDS-PAGE分析結果顯示，重組菌pET-32a-VP1/BL21經IPTG誘導5 h后其目的蛋白表達量達到峰值，在相對分子量44.0 kD處有一條明顯增量的蛋白條帶（圖5），與預期結果相符；重組菌pGEX-6P-1-VP1/BL21經IPTG誘導4 h后其目的蛋白表達量達到峰值，在相對分子量42.0 kD處出現一條明顯增量的蛋白條帶（圖6），與預期結果相符；而未經誘導的菌液無任何表達蛋白條帶出現。

2. 3 融合表達產物的可溶性分析結果

以1 mmol/L IPTG誘導3 h的重組菌pET-32a- VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/BL21經超聲波裂解后，收集超聲波裂解菌液離心所得上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析，結果顯示，兩種融合蛋白在菌體中主要以包涵體的形式存在（圖7）。

2. 4 融合蛋白的純化結果

蛋白包涵體經層析柱純化復性后，得到的融合蛋白進行SDS-PAGE分析鑒定，結果發現融合蛋白條帶大小與預期結果一致，且條帶較清晰、單一（圖8），說明融合蛋白純化效果較好。

2. 5 融合蛋白的Western blotting鑒定結果

對純化復性的融合蛋白pET-32a-VP1和pGEX- 6p-1-VP1進行Western blotting鑒定，結果顯示在預期目的處出現特異性反應條帶（圖9和圖10），說明誘導表達獲得的融合蛋白均能與豬抗O型FMDV陽性血清發生特異性結合，即具有免疫學活性。

3 討論

FMDV的VP1基因由639個核苷酸組成，共編碼213個氨基酸，是病毒結構中最重要的抗原位點及抗原變異的關鍵域區（Mateu et al.，1996；柳紀省，1999），可誘導動物機體產生中和抗體。VP1蛋白的第21～40位氨基酸肽段是重要的T細胞抗原蛋白（Collen et al.， 1991）；第141～160位、第200～213位氨基酸肽段能夠保護動物抵抗病毒攻擊，是重要的B細胞抗原表位（Bittle et al.，1983）；第40～60位氨基酸肽段具有調節第141～160位、第200～213位氨基酸抗原表位的功能，也是重要的B細胞抗原表位（Parry et al.，1990）。本研究選用的VP1多表位基因是由第21～60位、第141～160位及第200～213位氨基酸肽段串聯構成，既含T細胞表位，又含B細胞表位。邵軍軍和常惠蕓（2008）研究發現，可通過增加抗原表位、引入外源載體蛋白或T細胞表位等方法提高表位肽的免疫原性；在特異性免疫應答中，T細胞表位發揮重要作用，且部分B細胞表位也需要與T細胞表位相互作用才能誘導動物機體內產生抗體。因此，本研究選擇VP1全長基因及VP1多表位基因作為表達的目的基因，以期鑒定兩種目的基因表達所得融合蛋白的反應原性及特異性，并比較兩者間的差異，為下一步建立ELISA選擇合適的包被抗原及研制FMDV重組蛋白亞單位疫苗提供參考。

本研究誘導表達獲得的融合蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體是由于融合蛋白在其自身的表達過程中對環境不適應，導致不能形成正確的次級鍵或缺乏依稀蛋白質折疊的輔助因子等原因所形成（夏啟玉等，2007）。以包涵體形式存在的重組蛋白具有以下優點（羅莉等，2012）：（1）雜蛋白在包涵體中的含量較低，采用離心方法即可達到與可溶性蛋白分離的目的，便于分離純化；（2）可避免菌體蛋白酶對外源蛋白的降解；（3）降低了胞內外源蛋白濃度，利于目的蛋白表達量的提高；（4）包涵體對機械攪拌和超聲波破碎均不敏感，易與細胞膜碎片進行分離。但以包涵體形式存在的重組蛋白是需要經過變性劑溶解，再進行復性才能得到溶解的蛋白質。

本研究選取pET-32a和pGEX-6P-1為原核表達載體，其目的是為了避免載體自身表達蛋白與抗原蛋白產生非特異性結合，而產生假陽性對研究結果造成影響。大腸桿菌BL21（DE3）菌株是以T7 RNA聚合酶為表達系統的高效外源基因蛋白表達宿主，尤其適合于非毒性蛋白的表達。本研究選取大腸桿菌BL21（DE3）作為宿主菌表達FMDV的主要結構蛋白VP1及其主要抗原位點的基因蛋白，經SDS-PAGE分析和Werstern blotting鑒定，結果顯示，融合蛋白均得到正確表達。此外，選用大腸桿菌表達VP1多表位基因的蛋白作為包被抗原，可去除無關基因的干擾，提高包被抗原性，防止假陽性產生。

4 結論

本研究表達獲得的融合蛋白具有良好的反應原性，可作為包被抗原應用于O型FMDV抗體檢測試劑盒研發。

參考文獻：

何繼軍，楊亞民，馬維民，尚佑軍，呂律，鄭海學，靳野，郭建宏，劉在新，劉湘濤. 2015. 我國O型Mya-98口蹄疫病毒流行情況與毒株分析[J]. 中國動物檢疫科學，35（5）：45-51.

He J J，Yang Y M，Ma W M，Shang Y J，Lü L，Zheng H X，Jin Y，Guo J H，Liu Z X，Liu X T. 2015. Epidemic situation and characterization of O/Mya-98 strain of foot and mouth disease virus in China[J]. China Animal Health Inspection，35（5）：45-51.

李金光，嚴維耀，徐泉興，盛祖恬，鄭兆鑫. 2001. 以豬IgG重鏈恒定區為抗原載體的抗口蹄疫病毒的DNA疫苗的研制[J]. 生物工程學報，17（3）：322-324.

Li J G，Yan W Y，Xu Q X，Sheng Z T，Zheng Z X. 2001. Study on the DNA vaccine against foot-and-mouth disease virus using the heavy chain constant region of swine IgG as the carrier for peptide epitopes[J]. Chinese Journal of Biotechnology，17（3）：322-324.

梁特，楊德成，劉蒙蒙，周國輝，孫超，魏萍，于力. 2013. O型口蹄疫病毒衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達[J]. 中國預防獸醫學報，35（3）：185-188.

Liang T，Yang D C，Liu M M，Zhou G H，Sun C，Wei P，Yu L. 2013. Expression of capsid protein of serotype O foot-and-mouth disease virus in insect cells[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，35（3）：185-188.

劉暢，盧清俠，楊繼飛，王世紅，王寅彪，郭官鵬，鄧瑞廣，張改平. 2013. A型口蹄疫病毒結構蛋白VP1的表達純化及活性檢測[J]. 西北農業學報，22（9）：7-12.

Liu C，Lu Q X，Yang J F，Wang S H，Wang Y B，Guo G P，Deng R G，Zhang G P. 2013. Prokaryotic expression and activity analysis of VP1 of foot-and-mouth disease virus serotype A[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，22（9）：7-12.

柳紀省. 1999. 口蹄疫研究進展[J]. 中國獸醫科技，29（3）：17-22.

Liu J S. 1999. Research progress of food-and-mouth disease virus[J]. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology，29（3）：17-22.

羅莉，李坤，王保成，王明蓉. 2012. 包涵體變復性技術研究進展[J]. 中國醫藥生物技術，7（4）：290-293.

Luo L，Li K，Wang B C，Wang M R. 2012. Research progress in renaturation of inclusion body protein[J]. Chinese Medicinal Biotechnology，7（4）：290-293.

邵軍軍，常惠蕓. 2008. 口蹄疫多表位疫苗的研究進展[J]. 中國獸醫科學，38（11）：1009-1012.

Shao J J， Chang H Y. 2008. Advances in multiple-epitopes vaccines against foot-and-mouth disease[J]. Chinese Veterinary Science，38（11）：1009-1012.

特尼格爾，趙慧，小琴，陸繼爽，黃天鵬，格日勒圖. 2015. 多型FMDV VP1表位融合蛋白SLP-Multi VP1的純化及鑒定[J]. 中國獸醫學報，35（10）：1622-1625.

Teni Geer，Zhao H，Xiao Q，Lu J S，Huang T P，Geri Letu. 2015. Purification and characterization of VP1 epitope based fusion protein of multi-type FMDV[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，35（10）：1622-1625.

汪家政，范明. 2000. 蛋白質技術手冊[M]. 北京：科學出版社.

Wang J Z，Fang M. 2000. Protein Technical Manuals[M]. Beijing：Science Press.

夏啟玉，肖蘇生，鄧柳紅，易小平，張春發. 2007. 包涵體蛋白的復性研究進展[J]. 安徽農業科學，36（14）：5801-5803.

Xia Q Y，Xiao S S，Deng L H，Yi X P，Zhang C F. 2007. Research progress in renaturation of inclusion body protein[J]. Journal of Anhui Agriculral Science，36（14）：5801-5803.

解銀麗，馬琪，李志勇. 2015. O型口蹄疫病毒衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達及其抗原性鑒定[J]. 安徽農業科學，43（8）：95-97.

Xie Y L，Ma Q，Li Z Y. 2015. Expression and identification of capsid protein of foot-and-mouth disease virus type O in insect cells[J]. Journal of Anhui Agricultural Science，43（8）：95-97.

顏健華，何奇松，蔣家霞，馮淑萍，黃勝斌，胡巧云，易春華，許瑞勝，梁晟，熊毅. 2015. A 型口蹄疫病毒VP1蛋白競爭ELISA檢測方法的初步建立[J]. 西南農業學報，28（5）：2268-2272.

Yan J H，He Q S，Jiang J X，Feng S P，Huang S B，Hu Q Y，Yi C H，Xu R S，Liang S，Xiong Y. 2015. Establishment of competitive ELISA diagnose based on VP1 protein of foot and mouth disease virus serotype A[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，28（5）：2268-2272.

楊志軍，林焱，李金光，嚴維耀，徐泉興，尤永進，鄭兆鑫. 2000. 含T細胞表位和B細胞表位的抗O型FMDV基因工程疫苗誘導豚鼠產生免疫反應[J]. 復旦學報（自然科學版），39（5）：564-568.

Yang Z J，Lin Y，Li J G，Yan W Y，Xu Q X，You Y J，Zheng Z X. 2000. Recombinat vaccine containing both B cell and T cell epitopes induces guinea pig in immune responses against type O foot-and-mouth disease virus[J]. Journal of Fudan University（Natural Science），39（5）：564-568.

Bittle J L，Houghen R A，Alexander H，Shinnick T M，Sutcliffe J G，Lerner R A，Rowlands D J，Brown F. 1983. Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence[J]. Nature，298：31-33.

Collen T，Dimarchi R，Doel R. 1991. A T cell epitope in VP1 of food-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle[J]. Journal of Immunology，146（2）：749-755

Mateu M G，Valero M L，Andreu D，Domingo E. 1996. Systematic replacement of amino acid residues within an Arg-Gly-Asp-containing loop of foot-and-mouth disease virus and effect on cell recognition[J]. The Journal of Biological Chemistry，271（22）：12814-12819.

Parry N R，Fox G，Rowlands D，Brown F，Fry E，Acharya R，Logan D，Stuart D. 1990. Structural and serological evidence for a novel mechanism of antigenic variation in foot-and-mouth disease virus[J]. Nature，347：569-572.

Sobrino F，Sáiz M，Jiménez-Clavero M A，Núez J I，Rosas M F，Baranowski E，Lev V. 2001. Foot and-mouth disease virus：a long known virus，but a current threat[J]. Veterinary Research，32（1）：1-30.

（責任編輯 蘭宗寶）