一種植物病毒檢測新方法—納米上轉換熒光技術

張明哲, 陳 曦, 吳志毅, 張永江, 聞偉剛, 林曉佳陳吳健, 吳 蓉, 劉鵬程, 李明福

(1.浙江出入境檢驗檢疫局,杭州 310012; 2.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100029;3.寧波出入境檢驗檢疫局,寧波 315012; 4.杭州出入境檢驗檢疫局,杭州 310012;5.湖州出入境檢驗檢疫局,湖州 313000)

近年來,隨著我國人民生活水平不斷提高,對肉、蛋、奶的需求持續增加,進而帶動國內飼料養殖業對豆粕需求強勁,同時國內食用油消費逐年遞增,而國產大豆與國外轉基因大豆相比含油量低,價格較高,不具有競爭力,因此壓榨量呈現下降趨勢,進一步導致我國進口轉基因大豆大幅增長,國內大豆壓榨行業對進口大豆的依賴性增強。2009年我國大豆進口量達到4 255.2萬t,連續第5年創下歷史最高紀錄。

隨著大豆進口量不斷增加,菜豆莢斑駁病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)、煙草環斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)等有害生物隨大豆傳入風險也在逐步增大。僅2009年1-3月份舟山口岸就截獲菜豆莢斑駁病毒31批次,進口大豆的生物安全問題再一次引起人們的關注。據2007年5月農業部發布《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》統計,大豆可作為寄主的檢疫性病毒有：菜豆莢斑駁病毒(Bean pod mottle virus,BPMV),番茄環斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV),南芥菜花葉病毒(Arabismosaic virus,A rMV),南方菜豆花葉病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV),煙草環斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)等。這些病毒都是進境大豆種子必須檢疫的對象,屬于我國禁止進境的檢疫性有害生物,寄主范圍廣,危害大,一旦傳入我國并定殖下來,將很難根除,會對我國農業生產造成不可估量的損失。由于目前尚無有效的病毒防治方法,因此加強口岸檢疫工作是防止這些病毒傳入的唯一有效途徑。

1 目前主要使用的植物病毒檢測技術

目前主要使用的植物病毒檢測技術為血清學方法和分子生物學方法。

1.1 血清學方法

血清學方法具有嚴格的特異性和較高的靈敏度,是目前植物病毒檢測最為常用和有效的手段之一。植物病毒作為抗原,主要是通過其蛋白殼與特異性的抗體結合,使抗原失去活力,這種抗原抗體體外結合的過程叫做免疫反應,也叫血清反應[1]。由于不同病毒產生的抗血清都有各自的特性,因此可以用已知病毒的抗血清來鑒定病毒種類。而自從1977年,Clark等人首次將酶聯免疫吸附法(ELISA)應用于植物病毒檢測領域,ELISA法已成為血清學檢測植物病毒的首選方法,其基本原理是,以酶催化的顏色反應指示抗原抗體的結合[2]。目前國內植物檢疫主要使用的是雙抗體夾心ELISA法,該方法優點在于操作簡單,檢測時間短,但同時也存在檢測目標單一,進口商品化試劑盒價格高昂等缺點。

1.2 分子生物學方法

分子生物學檢測法是通過檢測病毒核酸(DNA,RNA)可將檢測靈敏度達到皮克(pg)級甚至飛克(fg)級,相比血清學方法具有更高的靈敏度,并且檢測的特異性更強,范圍更廣,對各種病毒、類病毒都可以檢測,還可以進行大批量的樣本檢測[1]。目前最常用的主要有反轉錄PCR(reverse transcrip tion po lymerase chain reaction,RT-PCR)、熒光定量PCR(real-time PCR)、核酸雜交技術(nucleic acid hybridization)、DNA微陣列技術(DNA microarray)等[4]。但是,分子檢測技術及其應用也存在一些不足,主要體現在(1)提取核酸和逆轉錄的過程都比較繁瑣和復雜,且容易產生非特異性擴增和假陽性結果;(2)對于苗木種子等核酸提取困難,常含有抑制物質,易造成結果的假陰性。

2 納米上轉換熒光技術及其應用

基于現狀,我國各出入境口岸及產地植物病毒檢驗檢疫迫切需要高靈敏、快捷簡便以及高通量的檢測新技術,而磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNP)和上轉換熒光(up-converting phosphor,UCP)材料的出現是解決這個問題的新亮點。

2.1 磁性納米顆粒

自從20世紀70年代磁性納米顆粒被首度用于生物分離后[5],近10年來,MNP已被廣泛用于生物活性物質的富集和分離。MNP是一類智能型的納米磁性材料,既具有納米材料所特有的性質如粒徑小,比表面極大,偶聯容量高,又具有磁響應性及超順磁性,可以在恒定磁場下聚集和定位[6]。通過對MNP表面不同修飾,具有表面活性基團,能進一步與藥物、抗體、蛋白質、酶、細胞及DNA等多種分子偶聯[7]。如：Lee等通過將Ni2+直接固定在丙二醇與環氧乙烷共聚物修飾的磁性Fe3 O4表面,形成Ni-MNPs,利用Ni對組氨酸標記的蛋白質的特異性,應用外部磁場將組氨酸標記的GFP從混合溶液中高效分離[8]。Tan等合成了一個基因磁性納米捕獲劑(GMNC),將其用于富集、分離和檢測痕量的具有單堿基錯配的DNA/mRNA分子[9]。

利用磁性納米顆粒易于磁性富集和磁性分離的特點,在其表面包被特異性抗體,從而順利完成病毒分離和富集等過程,具有檢測速度快和對人為因素不敏感等優點。但是僅利用納米磁性顆粒,只能對植物病毒進行富集,為了能更加快速迅捷的對病毒進行檢測,我們還需要一種生物標記手段,使病毒檢測的結果更加直觀。

2.2 上轉換熒光材料

上轉換發光(圖1),是指將兩個或兩個以上的低能光子轉換成一個高能光子的現象,一般特指將紅外光轉換成可見光[10]。近年來,上轉換熒光材料作為生物標記物普遍被用于生物檢測領域,與傳統的熒光標記物相比具有毒性低、化學穩定性好、發光強度高而穩定和Stokes位移大等優點[11]。

圖1 上轉換發光示意圖

這種材料主要由主基質(host matrix)、吸收子(absorber)和發射子(eMitter)3種成分構成[12]?？勺鳛橹骰|的晶體材料有：氧硫化物(如Y2 O2 S、GdO2 S、La2 O2 S 等)、氟化物(如 YF3、GdF3、LaF3等)、鎵酸鹽(如 YGaO3、Y3Ga5O12等)以及硅酸鹽(如YSi2 O5、YSi3 O7等)等;常作為吸收子的稀土金屬離子有：鐿離子(Yb3+)、鉺離子(Er3+)、釤離子(Sm3+)等;常作為發射子的稀土金屬離子有：鉺離子(Er3+)、鈥離子(Ho3+)、銩離子(Tm3+)、鋱離子(Tb3+)等[13]。吸收子和發射子這一離子對在主基質晶格內適宜的空間取向和距離,是產生上轉換發光的基礎。上轉換發光的過程(如圖1),就是UCP內的吸收子(如Yb3+)吸收低能量光子(紅外光區,如980 nm),在經過一系列的內部能量轉過后,將光子的能量連續傳遞給發射子(如Er3+),使其釋放一個高能光子(可見光區,如570 nm)的過程。

2.3 納米上轉換熒光技術

納米上轉換熒光技術一方面利用磁性納米顆粒作為載體對目標物進行分離、富集和定位;另一方面引入上轉換熒光材料作為標記物的免疫檢測方法。利用獨特的上轉換發光現象,將微觀進行的免疫反應以可見光信號的形式表現出來,并通過與集成化的光學電子元件相結合后,被物理換能器接收進而轉換為電壓值或電流值,并與目標被檢物的濃度值一一對應,從而實現定量檢測。

目前國內納米上轉換熒光技術研究,主要有Wang等以MNP作為核酸載體,UCP作為熒光標記物檢測DNA[14];Lu等以磁性納米Fe3O4為核,合成出具有磁性的Fe3 O4@NaYF4：Yb,Er上轉換熒光納米顆粒[15]。他們對這種上轉換熒光顆粒表面進行了氨基修飾,成功與鏈霉親和素連接,揭示了納米上轉換熒光技術在生物檢測方面的潛在應用。Guo等對合成的NaY4：Yb,Er上轉換熒光納米顆粒的表面進行修飾并將其作為標記物來檢測DNA的雜交,進而實現了對細菌的檢測[16]。

作者在這些研究的基礎上,將納米上轉換熒光技術拓展到植物病毒檢測領域,對MNP和UCP進行表面抗體修飾及表征,通過抗體抗原特異性結合進行病毒富集、分離和熒光標記,并采用多光譜影像檢測系統對特定波長熒光的有無以及強度分別進行定性和定量分析(圖2),從而實現高效、靈敏的檢測目標(數據未發表)。納米上轉換熒光技術應用于檢測植物病毒的優點在于高度的抗干擾性、多元性、穩定性、安全性：

(1)高度的抗干擾性：MNP智能型的納米磁性材質和UCP特殊的發光機制極大限度地降低了外界因素干擾。

(2)高度的多元性：MNP的磁響應性及超順磁性及UCP獨特的可自由組合的多樣化特征光譜使其具備了多重檢測的能力。

(3)高度的穩定性：UCP的發光現象是產生于結構內部的純粹物理過程,且其以能量較低的紅外光作為激發光,對植物病毒影響小。

(4)高度的安全性：MNP材料具有良好的生物安全性,UCP為惰性合成材料、激發光為紅外光對于檢測者、環境均無任何危害。

圖2 納米上轉換熒光技術在植物病毒檢測中的應用

3 結束語

植物病毒檢測技術經歷了傳統生物學檢測技術、血清學檢測技術和分子生物學檢測技術3個階段。目前,納米新材料、新技術的出現在病毒富集和分離、信號放大等環節為植物檢驗檢疫帶來新的突破和提高;納米材料和現有檢測技術的結合,將使整個檢測體系呈現出與以往不同的特性和功能,更預示著基于新穎物理原理的植物病毒檢測技術的誕生。

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