橡膠樹乳管表達HbHMGR1基因雙元表達載體構建與鑒定

賀永國 李哲 黃綿佳 曾憲海 林位夫 劉潔瓊 張春紅 馬曉曉

摘要：【目的】克隆橡膠樹乳管特異性強啟動子HEV2.1（PHEV2.1），構建天然橡膠生物合成途徑關鍵限速酶基因（HbHMGR1）的乳管特異性植物表達載體，為橡膠樹遺傳轉化奠定基礎?！痉椒ā扛鶕褕蟮赖腍EV2.1序列（GenBank登錄號AY247789.1）設計1對特異引物，采用PCR從橡膠樹熱研7-33-97基因組DNA中克隆PHEV2.1，與HbHMGR1基因融合構建橡膠樹乳管特異性植物表達載體，并以PCR和限制性內切酶酶切進行鑒定?！窘Y果】用特異引物可從熱研7-33-97基因組DNA中擴增獲得1852 bp的PHEV2.1片段，其與AY247789.1啟動子序列的同源性為98.6%。將PHEV2.1與HbHMGR1基因融合構建乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，經PCR和限制性內切酶酶切鑒定證明植物表達載體構建成功。【結論】將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上，能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現Pst I突變、阻礙載體構建的難題，成功構建獲得乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

關鍵詞： 橡膠樹；乳管特異性啟動子PHEV2.1；HbHMGR1基因；植物表達載體；構建；鑒定

中圖分類號： S794.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）02-0163-06

0 引言

【研究意義】轉錄水平調控是基因表達調控的主要環節，對植物啟動子功能進行研究不僅可以揭示相應基因的表達模式，還能為利用植物基因工程技術實現基因的高效特異性表達提供有效途徑。橡膠蛋白（Hevein）是膠乳的主要成分，可在乳管中高效表達，占可溶性蛋白質的50%～70%，其基因家族成員HEV2.1基因啟動子是乳管特異表達的強啟動子（Van Parijs et al.，1991；Montoro et al.，2008）。橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶1（HbHMGR1）是橡膠生物合成途徑的關鍵限速酶（Lynen，1969；Chye et al.，1992；馬曉曉等，2014），因此利用HEV2.1基因啟動子和HbHMGR1基因構建乳管特異性表達載體以轉化橡膠樹，對提高橡膠樹的產量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】早在20世紀60年代橡膠蛋白就已被認識（Archer，1960），但在隨后的40年間除Broekaert等（1990）成功克隆獲得過一個編碼橡膠蛋白的cDNA序列（GenBank登錄號M36986）外，有關編碼橡膠蛋白基因及啟動子的研究鮮有報道。2005年，Pujade-Renaud等利用文庫篩選法從橡膠樹基因組DNA中分離獲得5個編碼橡膠蛋白的基因，首次證明橡膠蛋白是由一個小基因家族所編碼；同時克隆獲得HEV1.1啟動子（PHEV1.1）和HEV2.1啟動子（PHEV2.1），并融合uidA基因轉化水稻，結果發現這兩個啟動子均能在轉基因水稻中驅動uidA基因的表達，且以PHEV2.1的功能最強，能驅動uidA基因在轉基因水稻的許多組織中高水平表達。Montoro等（2008）利用PHEV2.1融合uidA基因，并轉化橡膠樹分析其表達特性，結果表明，PHEV2.1驅動uidA基因在根、莖、葉的乳管中特異性強表達，印證了Archer等（1969）關于橡膠蛋白在乳管細胞中特異性表達的觀點；隨后還發現PHEV2.1可受光誘導，驅動uidA基因在葉片所有細胞類型中表達?！颈狙芯壳腥朦c】目前尚無利用PHEV2.1構建HbHMGR1乳管特異性表達載體的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】通過提取橡膠樹高產品種葉片基因組DNA，克隆橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1，用其構建乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，以期為下一步橡膠樹遺傳轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

橡膠樹優良品種熱研7-33-97的幼嫩葉片采自中國熱帶農業科學院橡膠研究所橡膠樹國家種質圃，用于提取基因組DNA。植物表達載體pCAMBIA2301-MCS（T-DNA：35S poly A-NPTII-35S promoter-NOS terminator-MCS-35S promoter-uidA-NOS Poly A）與HbHMGR1基因由農業部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室提供；pCAMBIA3301載體由海南大學畢政鴻惠贈；大腸桿菌Trans5α購自北京全式金生物技術有限公司；克隆載體pMD19-T、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質粒提取及純化試劑盒購自美國Omega公司；限制性內切酶Hind III、Pst I和Xma I購自美國NEB公司；其他試劑均為國產分析純。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 橡膠樹葉片基因組DNA提取 橡膠樹葉片基因組DNA提取參照鐘淦彬等（2010）和鄒智等（2014）的方法進行小量提取。

1. 2. 2 橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1克隆 根據Pujade-Renaud等（2005）報道的HEV2.1序列（NCBI登錄號AY247789）截取起始密碼子前的1830 bp堿基序列，用Primer 5.0設計1對特異性引物PHF1（5'-CCC

因組DNA為模板，以PHF1和PHR1為引物進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳、回收、加尾“A”后，克隆至pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌Trans5α，經12～16 h的培養后挑取單菌落進行PCR檢測，選取PCR檢測呈陽性的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果用NCBI網上的BLASTn工具進行序列同源性分析。

1. 2. 3 HbHMGR1乳管特異性植物表達載體構建及酶切鑒定 分別以Xba I和Xma I對pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGR1進行雙酶切，酶切產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301-HbHMGR1的小片段，將兩片段用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌Trans5α，過夜培養后挑取單菌落進行PCR檢測，提取陽性重組質粒pCAMBIA3301-HbHMGR1；再用Hind III和Pst I分別對pCAMBIA3301-HbHMGR1和pMD19-T-PHEV2.1進行雙酶切，電泳結束后對pCAMBIA3301-HbHMGR1的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段進行切膠回收，回收產物用T4 DNA連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌Trans5α，過夜培養后挑取單菌落進行PCR檢測，提取陽性重組質粒，并用Hind III、Pst I和Xma I對其進行酶切鑒定，確認是否得到陽性重組質粒為pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1；最后用Hind III和Xma I將PHEV2.1-HbHMGR1重組片段從pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1上切下，將其連接到pCAMBIA2301-MCS的Hind III和Xma I間，獲得植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，轉化大腸桿菌Trans5α，挑取單菌落進行菌落PCR，提取陽性重組質粒，用Hind III和Xma I進行酶切鑒定，確認HbHMGR1乳管特異性植物表達載體構建是否成功。

2 結果與分析

2. 1 橡膠樹葉片基因組DNA的提取結果

從橡膠樹熱研7-33-97的葉片中小量提取基因組DNA，取2.0 μL稀釋5倍后進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其純度。由圖1可以看出，提取獲得的橡膠樹葉片基因組DNA條帶整齊、清晰、完整性好、無明顯的雜質和降解現象。利用微型紫外分光光度計測定，其濃度約100 ng/μL。

2. 2 橡膠樹乳管特異性啟動子PHEV2.1的克隆及序列分析結果

以橡膠樹熱研7-33-97的葉片基因組DNA為模板，用特異性引物PHF1和PHR1進行PCR擴增，獲得一條近2000 bp左右的條帶。經生工生物工程（上海）股份有限公司測序結果證實，從熱研7-33-97基因組中擴增獲得的PHEV2.1為1852 bp。將所獲得的序列錄入NCBI的BLASTn數據庫（http：//blast.Ncbi.Nlm.Nih.gov/ Blast.cgi？ PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BLastSea-

rch&LINK_LOC=blasthome）與Pujade-Renaud等（2005）報道的PHEV2.1序列（GenBank登錄號AY247789.1）進行同源性比對分析，結果顯示，克隆獲得的PHEV2.1啟動子序列與AY247789.1啟動子序列的同源性為98.6%，相對于AY247789.1啟動子序列（以此堿基序號為準），其差異主要表現為：164G突變為T，475T和476T間多了一個AT， 582T突變為A，591T和592T間多了一段CACA

TATTTTGCCTCTGTT序列，845C突變為T，874A和875T間多了一個A。

2. 3 植物表達載體的酶切鑒定結果

分別采用Hind III、Pst I、Xma I和Hind III、Xma I對pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進行酶切，其中，三酶切獲得一條與雙酶切等同的大片段和一條近2000 bp的條帶，近2000 bp的條帶為大小相近的PHEV2.1片段（1852 bp）和HbHMGR1片段（1728 bp），兩者由于大小相近而重疊顯示為一條條帶。此外，雙酶切獲得的小片段介于3000～5000 bp，與3592 bp的PHEV2.1-HbHMGR1重組片段大小一致。再以PHEV2.1的上游引物PHHF和HbHMGR1的下游引物PHHR對pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1進行PCR擴增，也獲得一條介于3000～5000 bp的條帶，與雙酶切獲得的小片段一致，說明中間植物表達載體pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1已構建成功。

提取質粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，以pCAMBIA2301-MCS為陰性對照、pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1為陽性對照，分別采用Hind III和Xma I對其進行雙酶切，結果表明，pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1經雙酶切后得到一條與陽性對照小片段等同且介于3000～5000 bp的小片段和一條在10000 bp以上的大片段，小片段與PHEV2.1-

3 討論

由于生物具有遺傳多樣性，即使是同一物種不同品種間的基因組DNA在遺傳組成上也存在差異，從不同品種基因組中克隆獲得的同源啟動子也時有差異。魯旭（2014）在研究橡膠樹HbFCA功能時，用DNAMAN軟件對比了克隆自熱研7-33-97、邊沁橡膠、少花橡膠、光亮橡膠、光亮矮生橡膠、2131野生種、色寶橡膠、熱研幼花和熱研預測等9個橡膠樹品種的HbFCA啟動子，結果發現9個品種的HbFCA啟動子同源性為98.77%，其中熱研幼花與熱研預測的相似性達99.95%。這種現象同樣存在于單子葉植物中，蕭鳳回（2008）通過分析大麥、水稻干旱可誘導基因LEA啟動子，發現克隆自不同品種的同源啟動子序列間均存在一定差異。本研究根據Pujade-Renaud等（2005）報道的PHEV2.1序列（GenBank登錄號AY247789.1）設計引物，以橡膠樹熱研7-33-97的基因組DNA為模板，多次PCR擴增均獲得一段1852 bp的序列，經BLASTn比對分析證實，多次克隆獲得的序列均相同，但與Pujade-Renaud等（2005）克隆自橡膠樹品種RRIM600的PHEV2.1序列略有差異，同源性為98.6%。

HbHMGR1是橡膠生物合成途徑的關鍵限速酶（Lynen，1969；Chye et al.，1992；馬曉曉等，2014），其基因在乳管中特異性表達（Chye et al.，1991）。因此，提高HbHMGR1基因在橡膠樹乳管中的表達量，對促進橡膠的生物合成及提高其產量具有重要意義。原始的植物表達載體pCAMBIA2301理論上只有唯一的1個Pst I限制性酶切位點，但實際應用中的pCAMBIA2301載體上常存在2個突變增加的Pst I酶切位點。為此，本研究將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構建到pCAMBIA3301載體上，經雙酶切后再克隆至pCAMBIA2301載體上，能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301上出現Pst I突變、阻礙載體構建的難題，成功構建獲得乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-

PHEV2.1-HbHMGR1。該研究結果為進一步利用乳管特異性表達載體轉化橡膠樹及研究HbHMGR1基因在乳管中表達促進膠乳生物合成的機理奠定了基礎。

4 結論

將PHEV2.1和HbHMGR1基因先構建到pCAMBIA3301載體上再克隆至pCAMBIA2301載體上，能有效解決直接克隆至pCAMBIA2301載體上出現Pst I突變、阻礙載體構建的難題，成功構建獲得乳管特異性植物表達載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

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（責任編輯 蘭宗寶）