雙價抗蟲轉基因水稻的育成及初步鑒定

崔彥芹 李尚偉 張麗萍 羅洪發 李云峰 查仁明

摘要：【目的】構建雙價抗蟲基因表達載體并轉化水稻，為選育廣譜、高抗轉基因抗蟲水稻提供技術參考。【方法】構建半夏凝集素基因（pta）和蘇云金桿芽孢菌基因（Bt）兩個抗蟲基因的雙價表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta，利用大腸桿菌DH5α和根癌農桿菌LBA4404轉化水稻恢復系輻恢838，同時對轉化植株進行GUS染色及PCR鑒定。【結果】以構建的雙價植物表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta為模板，PCR擴增到pta基因的部分片段，大小為807 bp，且該載體經Hind Ⅲ酶切后，能得到15854 bp的中間載體pCAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段。對轉化植株進行GUS染色，得到3株轉基因陽性植株，經PCR鑒定結果顯示外源基因已成功導入水稻。【結論】通過構建雙價抗蟲基因表達載體并轉化水稻，成功獲得的轉基因植株可用于水稻抗蟲轉基因恢復系及組合的研究，以提高其抗病蟲害能力。

關鍵詞： Bt基因；pta基因；載體構建；轉基因水稻；鑒定

中圖分類號： S511.035.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）02-0169-05

0 引言

【研究意義】水稻是最重要的糧食作物之一，世界上半數以上的人口以水稻為主食。蟲害是造成水稻減產的主要原因，據報道，田間水稻害蟲種類在624種以上，每年因螟蟲造成的產量損失達1.0×1010 t，對其品質也造成嚴重威脅（劉立軍等，2009；朱禎，2010；張嵐等，2011），因此選育抗蟲水稻品種尤為重要，但僅靠常規育種難以解決抗蟲育種資源稀缺的問題，須通過研究轉基因水稻來完成。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）基因的表達產物為Bt毒蛋白，是一種殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal protein，ICP），其殺蟲效果安全、高效，對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲具有高度特異性（孟志剛，2012）。半夏凝集素（Pinellia ternate agglutinin，pta）對同翅目害蟲如稻飛虱、葉蟬等有顯著抗蟲作用，故pta基因常作為外源基因應用于轉基因抗蟲作物研究（趙歡和彭正松，2014）。在抗蟲育種時，若能將兩個基因同時導入作物中，便可避免抗性基因的單一性和脆弱性，維持作物抗蟲的持久性。【前人研究進展】近年來，隨著植物基因工程的快速發展，通過轉基因技術將外源基因導入植物，使其自身攜帶抗蟲能力以達到抗蟲目的（韓蘭芝等，2006）。熊恒碩等（2008）將含有CryIA（a）/CryIA（c）、pta和Bar基因的雙價植物表達載體p3300-Bt-pta轉化苜蓿子葉，成功獲得陽性轉化植株。田強強等（2011）構建的雙價抗病蟲基因植物表達載體Lc-ChiA-pBI121可用于植物轉基因研究，提高植物抗病蟲害能力。Xiao等（2012）將pta和Cry1Ac基因同時導入大青，發現其協同作用可使植株對飛蛾和蚜蟲的抗性增強。張學明等（2015）用植物表達載體pC1301-LoxRi和pCAMBIA3301-KTi-SBA，構建雙價表達載體pCAMBIA3301-SBA-Lox并轉化大豆，獲得轉基因大豆。【本研究切入點】鱗翅目和同翅目是危害水稻較嚴重的昆蟲種類，Bt和pta基因分別對這兩類昆蟲有顯著抗蟲作用，但目前尚無將Bt和pta基因同時導入水稻而獲得廣譜性抗蟲水稻的研究報道。【擬解決的關鍵問題】構建雙價植物表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta，轉化水稻恢復系輻恢838，以期獲得廣譜性抗蟲水稻，為獲得高抗、廣譜抗蟲水稻材料提供基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

受體材料為水稻優良恢復系輻恢838，由貴州大學農學院提供；大腸桿菌DH5α和根癌農桿菌LBA4404由西南大學水稻研究所提供。雙酶切載體pCAMBIA1301和質粒pUC57-Bt和pCU57-pta由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。BamH I、Spe I等限制性內切酶、T4 DNA連接酶、GUS染液、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒及其他重要試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設備：瓊脂糖電泳儀（美國BIO-RAD公司）、UVP凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司）、微量移液器（德國Eppendorf公司）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 表達載體構建 用BamH I和Spe I雙酶切載體pCAMBIA1301和質粒pUC57-Bt，再用T4 DNA連接酶將兩者連接可獲得中間載體pCAMBIA1301-Bt，最后用Hind Ⅲ酶切質粒pCU57-pta和中間載體，并連接構建雙價植物表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta。

1. 2. 2 載體轉化及鑒定 用熱激法將構建的載體轉化大腸桿菌DH5α，經抗生素篩選、PCR鑒定（引物見表1，反應體系見表2，擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存備用）、Hind Ⅲ酶切鑒定和測序，獲得陽性克隆子。再用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒，用凍融法將其轉化根癌農桿菌LBA4404，對農桿菌進行PCR和酶切鑒定，操作方法與大腸桿菌同（Sambrook and David，2002）。

1. 2. 3 含Bt-pta基因的農桿菌轉化水稻 將含Bt-pta的根癌農桿菌LBA4404送至武漢泊遠生物科技有限公司，經水稻成熟胚預處理、農桿菌侵染、篩選Ⅰ、篩選Ⅱ、分化、生根及分子檢測等，以獲得Bt-pta雙價抗蟲轉基因水稻。

1. 2. 4 GUS組織化學染色 將轉基因水稻植株的嫩葉剪切后放于0.2 mL PCR管中，加入適量GUS染液，37 ℃下染色3～20 h，至藍色清晰可見。

1. 2. 5 PCR檢測 根據pta、GUS及Bt基因序列設計引物（表1）。PCR反應體系（25.00 μL）：DNA模板 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，10 mmol/L dNTPs 0.50 μL，引物F1和R1各1.50 μL，Taq DNA polymerase 0.25 μL，加滅菌水至25.00 μL。擴增程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃ 30 s，59～60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

2 結果與分析

2. 1 表達載體的構建及鑒定結果

構建的植物表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta如圖1所示。表達載體轉化大腸桿菌DH5α后，經含抗生素培養基篩選，挑取大腸桿菌菌落進行PCR鑒定，結果見圖2，擴增產物大小約807 bp，與預期結果相符，可初步鑒定為陽性克隆。提取陽性大腸桿菌質粒，經Hind Ⅲ酶切后（圖3），得到15854 bp的中間載體pCAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段（已插入酶切位點），表明目的基因pta已連接至中間載體pCAMBIA1301-Bt上，成功構建雙價植物表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta。

2. 2 轉基因陽性植株的鑒定結果

轉化再生水稻植株經馴化、移栽后，共獲得15株轉化植株，取其幼嫩葉片剪碎后進行GUS染色，結果如圖4所示，其中3株為轉基因陽性植株。對3株陽性植株的pta、Bt及GUS基因分別進行PCR檢測，結果如圖5和圖6所示。Bt基因檢測結果表明，除陰性對照未擴增出目的片段外，陽性對照（陽性質粒）及GUS染色呈陽性的3株轉基因植株檢測結果均與預期結果（396 bp）相符；pta基因檢測結果表明，陽性對照（陽性質粒）及GUS染色呈陽性的3株轉基因植株檢測結果均與預期結果（314 bp）相符；GUS基因檢測結果表明，除陰性對照未擴增出目的片段外，陽性對照（陽性質粒）及GUS染色呈陽性的3株轉基因植株檢測結果也與預期結果（350 bp）相符。

3 討論

目前單價轉基因技術逐漸成熟，已廣泛應用于農作育種的研究領域。Datta等（1998）將Cry1Ab基因導入各種秈稻和粳稻中，獲得一系列對三化螟幼蟲具有高致死率的轉Bt基因水稻；張紅宇等（2003）首次成功將從半夏花序中克隆的半夏凝集素基因導入3個水稻品種，為pta基因在水稻抗蟲上的應用奠定基礎；戴軍等（2014）將Bt cry1Ah基因導入玉米自交系綜31中，獲得1株對玉米螟有顯著抗性的轉基因植株。隨著轉基因抗蟲育種研究的深入，存在的問題日益凸顯，如轉單價抗蟲基因植株抗蟲譜單一，害蟲易產生抗性等。因此，近年國內外的轉基因研究呈現由單一基因向多基因發展的趨勢（余桂容等，2015）。隨著技術的不斷成熟，可成功構建雙價表達載體并轉化小麥、煙草等作物中，培育出多種雙價轉基因植株，如范媛媛等（2004）構建了植物表達載體p3300-Bt-pta并轉化煙草，獲得轉基因抗蟲煙草；Yu和Wei（2008）將Bt和pta基因轉化小麥，并獲得雙價抗蟲轉基因小麥。

本研究通過構建雙價抗蟲基因表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta并轉化水稻，由于該植物表達載體是以GUS基因為報告基因，可通過檢測報告基因的表達產物來快速篩選轉基因陽性植株。但在將轉基因水稻從人工氣候箱移栽到海南三亞大田過程中，由于環境變化和長時間運輸導致大量禾苗死亡，只得到3株陽性轉基因植株，由于其數量較少，為確保數據的準確性，未對其進行農藝形狀分析。此外，本研究僅對T0代轉基因植株進行初步的篩選和鑒定，根據孟德爾遺傳定律，基因在后代會產生分離，為得到純合和穩定遺傳的植株，需進一步對轉基因植株的后代進行分子檢測如Southern blotting、Western blotting等及連續多代自交篩選和鑒定，將出現性狀分離的植株淘汰，篩選出高代純合轉基因植株，并對轉基因后代純系進行株高、產量及相關性狀考察及抗蟲性鑒定。

4 結論

本研究篩選出3株Bt-pta雙價轉基因水稻，可用于水稻抗蟲轉基因恢復系及組合的研究，以提高其抗病蟲害能力。

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（責任編輯 陳 燕）