醌氧化還原酶抑制劑對乳腺癌細胞抑制作用的研究

田宇佳 朱坤 龐春慧 陳麗艷

摘 要：乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一。研究表明，乳腺癌的增殖及耐藥是導致患者死亡的主要原因。因此，明確乳腺癌的發生發展機制，尋找有效的治療靶點是延長乳腺癌患者生存時間的關鍵。最近研究表明，醌氧化還原酶在多種腫瘤中表達異常增高，并與腫瘤的不良預后密切相關。本研究通過在乳腺癌細胞株T47D中給予醌氧化還原酶抑制劑β-拉帕醌，觀察其對乳腺癌細胞增殖作用的影響，并探討可能的分子機制。

關鍵詞：乳腺癌；細胞；蛋白

1 材料

1.1 試劑和儀器

DMEM細胞培養液、小牛血清、胰蛋白酶購自Hyclone公司，MTT購自Sigma公司，β-拉帕醌購自Selleck公司；Bcl-2、Bax一抗購自Cell Signaling公司。

1.2 細胞培養

T47D細胞在含10%小牛血清的DMEM培養液內，置于37℃培養箱中培養。細胞單層貼壁生長至70%～80%融合時，以0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

1.3 實驗分組

對照組；β-拉帕醌高（8umol/L）、中（4umol/L）、低（2umol/L）劑量組。

2 方法

2.1 細胞增殖抑制實驗

取對數增殖期細胞接種于96孔培養板，貼壁后給藥，分別培養24、48、72 h。加入預先配制的MTT液50uL，37℃繼續孵育4 h。加入150uL DMSO后，在波長490 nm處測定各孔光吸收值（A），按下列公式計算細胞增殖抑制率：

細胞增殖抑制率（%）

=[1-（A給藥組-A空白對照組）/（A陰性對照組-A空白對照組）]×100

2.2 蛋白印跡法檢測凋亡蛋白的表達

提取各組細胞蛋白，SDS-PAGE分離，電轉并5%脫脂奶粉封閉，加入一抗4℃反應過夜；二抗室溫反應60 min；ECL增強發光。以actin蛋白作內參照，圖像分析軟件進行半定量分析。

2.3 統計學處理

用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析。

3 實驗結果

3.1 細胞的增殖抑制作用

MTT檢測結果顯示， β-拉帕醌分別作用T47D細胞24、48和72h后，細胞增殖速度下降明顯，結果見表1。

3.2 凋亡相關蛋白的表達

蛋白印跡檢測結果顯示， 用藥組細胞bcl-2表達明顯下降，而bax蛋白表達明顯增加，用藥組bcl-2/bax比值明顯降低，見圖2。

4 討論

凋亡普遍存在于大多數腫瘤組織細胞中，與腫瘤的發生、發展及退化有密切的關系。因此，誘導瘤細胞凋亡已成為腫瘤治療的一個新熱點。本實驗中MTT結果顯示β-拉帕醌對乳腺癌細胞T47D的增殖具有明顯的抑制作用，并具有量效關系。

凋亡的過程受到多基因調控。Bcl-2和Bax是一對凋亡相關調控基因，Bcl-2主要通過與其家族成員Bax形成二聚體而發揮作用，當Bcl-2表達量較高時，Bcl-2和Bax形成異源二聚體而抑制凋亡；當Bax表達較高時，bax之間形成同源二聚體而促進凋亡。在本實驗中，用藥組Bcl-2蛋白表達則明顯減弱，Bax蛋白表達明顯增強，Bcl-2/Bax比值明顯降低，說明β-拉帕醌可有效誘導乳腺癌細胞凋亡，這可能是抑制乳腺癌細胞增殖的機制之一。

參考文獻：

[1] 石建偉，唐智柳，蔡美玉.2008～2012年我國女性乳腺癌流行狀況的系統性綜述.中國婦幼保健，2014，29：1622-1626.

[2] Fagerholm R，Sprott K，Heikkinen T，et al.Overabundant FANCD2，alone and combined with NQO1， is a sensitive marker of adverse prognosis in breast cancer. Ann Oncol. 2013， 24（11）：2780-5.

[3] Yao B T， Wu M， Wang B. Experimental research on repairing myocardial cells of viral myocarditis by study on inhibiting action of hydrochloric berberine on expression of bcl-2 in cells of precancerous lesion in experimental rat model. China journal of traditional chinese medicine and pharmacy，2005.20（3）：186-187.

基金項目：延邊大學本科生創新課題（2015）

通訊作者：陳麗艷