白芨內生細菌組成及多樣性分析

陳澤斌 李冰 王定康 徐勝光 劉佳妮 余磊 張永福 任禛 靳松

摘要：【目的】調查白芨內生細菌種類及多樣性，為更好地保護和開發利用白芨資源提供科學依據。【方法】應用Illumina MiSeq高通量測序技術測定白芨內生細菌的16S rDNA-V4變異區序列，應用Qiime和Mothur等軟件整理和統計樣品序列數目和操作分類單元（OTUs）數量，分析物種豐度及分布的差異。【結果】獲得用于分析的有效序列和OTU數為49550/48；稀釋曲線表明測序深度充分，OTU的數量接近于飽和。白芨內生細菌主要分布于鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，32.26%）、地桿菌屬（Pedobacter，16.13%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，16.13%）、土壤桿菌屬（Agrobacterium，12.90%）、Kaistobacter屬（6.45%）、希瓦氏菌屬（Shewanella， 6.45%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，6.45%）和短波單胞菌屬（Brevundimonas，3.23%）8個屬。【結論】鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬是白芨內生細菌的優勢種群。Illumina MiSeq高通量測序技術能準確反映植物內生微生物的種類組成和真實比例，在植物內生微生物研究中具有明顯的優勢和可行性。

關鍵詞： 高通量測序；白芨；內生細菌；多樣性

中圖分類號： Q939.5 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）02-0227-07

0 引言

【研究意義】白芨（Bletilla striata）又名連及草、甘根、白給、箬蘭、朱蘭、紫蘭、紫蕙、百笠，為多年生草本球根植物（塊根），株高18～60 cm，主要分布于我國、日本及緬甸北部（趙杰和毛曉健，2008）。白芨具有廣泛的藥用價值和園林價值，藥用主要用于收斂止血、消腫生肌（和志嬌等，2008）。白芨的種子自然萌發率極低，繁殖困難，野生資源稀少，由于需求量大，野生資源已瀕臨枯竭，現已列入《瀕危動植物種國際貿易公約》予以保護（林福林等，2013）。內生菌是指其生活史中的某一段時期生活在健康植物組織內部，不引起植物組織明顯侵染及癥狀改變的一類菌（Schulz et al.，2006）。關于植物內生細菌，現已從多種健康植物的根、莖、葉、果實和種子中分離出包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌共計達219種（隸屬于71個屬）植物內生細菌（Schulz et al.，2006）。目前比較系統研究的植物有棉花、小麥、水稻和花生（胡桂萍等，2010），發現優勢種類主要分布于假單胞屬（Pseudommonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和土壤桿菌屬（Agrobacterium）4個屬，且尚未發現不存在內生細菌的植物種類或器官（徐亞軍，2011）。已有研究表明，內生細菌在植物種子萌發（候曉強和郭順星，2014）、抵御病原菌侵染（何勁等，2014）、促進幼苗生長中起著重要作用（徐文婷等，2014），同時內生細菌也是生物活性物質篩選的重要來源（童文君等，2014）。研究植物內生細菌多樣性，對揭示植物內生細菌的相互作用機制，有效利用內生細菌資源具有重要意義。白芨是溫帶地生蘭科植物中最具經濟價值的類群之一，因此有必要對白芨內生細菌的種類組成進行研究。【前人研究進展】近年來，植物內生菌作為生物活性物質篩選的重要來源已引起人們的廣泛關注（郭良棟，2001；任愛梅等，2010；Sun and Guo，2012）。在藥用植物內生真菌研究方面，自Stierle等（1993）從短葉紅豆杉的樹皮中分離得到一株能產紫杉醇的內生真菌以來，藥用植物內生真菌成為研究熱點（楊顯志等，2003；樊有賦等，2008；杜少康等，2009），研究發現藥用植物內生真菌多以雙核菌門子囊菌亞門中的核菌綱、盤菌綱和腔菌綱及其無性態型組成，也包括一些擔子菌和接合菌（Petrini et al.，1991；Sinclair and Cerkauskas，1996）。在藥用植物內生細菌研究方面，發現藥用植物內生細菌優勢類群多為芽孢桿菌屬細菌。魏娟等（2015）對云南重樓的內生細菌分別進行分離鑒定，發現芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬是其優勢內生細菌群；童文君等（2014）對美花石斛內生細菌進行分離鑒定，發現芽孢桿菌屬、微桿菌屬和腸桿菌屬為優勢屬；楊夢莉等（2014）對巖白菜中內生細菌進行分離鑒定，發現芽孢桿菌屬和假單孢屬為其優勢屬；李淑彬等（2015）對高良姜內生細菌進行分離鑒定，發現芽孢桿菌、甲基桿菌分別為其最、次優勢種群；杜曉寧等（2015）對寧夏枸杞中內生細菌進行分離鑒定，發現芽孢桿菌屬為枸杞優勢內生菌群。但是現有研究表明，分離培養方法分析的細菌僅限于那些能夠在人工培養基上生長的細菌，這些可培養細菌僅占環境生物總數的0.1%～10.0%（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999），因此有必要采用非培養方法對植物內生細菌種類組成進行研究。【本研究切入點】目前關于白芨的研究主要集中在人工繁殖、化學成分分析和藥理作用等方面（劉瑩等，2008；袁寧等，2009；孫達鋒等，2009），有關白芨內生細菌多樣性的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】采用近年來新興起的個人型高通量DNA測序系統（Illumina MiSeq）對白芨內生細菌種類組成進行研究，以檢測采用傳統純培養和非培養技術未能發現的低豐度植物內生細菌種類，探究白芨內生細菌種類多樣性，為更好地保護和開發利用白芨資源提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2014年8月于云南盛南白芨種植基地采集20株無明顯病害的白芨，取白芨假鱗莖塊根部分為分析樣品，均勻混合后放入無菌樣品袋中，低溫保鮮，于24 h內進行表面消毒處理，樣品名為BJ。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 表面消毒 將新鮮白芨假鱗莖塊根部分用自來水沖洗干凈，再用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分。表面消毒效果檢驗參照陳澤斌等（2014）的方法。

1. 2. 2 總DNA提取 按陳澤斌等（2012）的方法提取白芨假鱗莖塊根總DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的純度和濃度。取適量樣品于離心管中，用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1. 2. 3 16S rDNA-V4區的PCR擴增 以稀釋后的基因組DNA為模板，用帶Barcode的16S rDNA-V4區特異引物515F（5'-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGT

AA-3'）和806R（5'-AGTTCCGGACTACHVGGGTWTC

TAAT-3'），使用高效和高保真酶（New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）進行PCR，確保擴增效率和準確性。

1. 2. 4 PCR產物的混樣和純化 PCR產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用Thermo Scientific公司的Gene JET膠回收試劑盒切膠回收產物。

1. 2. 5 文庫構建和上機測序 用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經Qubit和QPCR定量，文庫合格后，使用Miseq進行上機測序（Youssef et al.，2009；Caporaso et al.，2011；Hess et al.，2011；Luo et al.，2012）。測序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1. 3 生物信息學分析

測序得到的原始數據存在一定比例的干擾數據，為了使信息分析的結果更加準確、可靠，首先對原始數據經過拼接、過濾、去嵌合體后得到有效數據（Edgar et al.，2011），剔除宿主葉綠體和線粒體序列，然后對有效數據在97%水平上進行OUT聚類，并利用Greengene數據庫進行物種注釋（Edgar，2013）。通過對OTUs進行豐度、Alpha多樣性及物種在各分類水平上的群落結果統計分析，可以得到微生物群落組成（Wang et al.，2007）；再通過Beta多樣性分析，研究環境樣本間的微生物群落結構差異（DeSantis et al.，2006）。

1. 4 數據分析

利用Uparse（version 7.1 http：//qiime.org/）軟件平臺進行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各水平上統計每個樣品的群落組成；利用Mothur軟件進行稀釋曲線分析；分別利用香農指數（Shannon）、辛普森指數（Simpson）和物種豐富度指數（ACE）公式計算細菌生態多樣性指數；利用Fasttree軟件+R語言制作熱圖；利用諾禾致源自主開發的SVG軟件制作特定物種分類樹圖。

2 結果與分析

2. 1 序列長度分布

白芨樣品所測得的49580條PE Reads長度分布在191～351 bp范圍內，其中以長度為251 bp的序列最多，有48987條（圖1）。從序列長度的分布來看，與16S rDNA-V4區序列長度大致吻合。

2. 2 樣品復雜度分析

從稀釋曲線（圖2）可以看出，隨著測序數量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨向平坦但未進入平臺期，說明再增加測序數量也只會產生少量新的OTUs；從Chao1指數曲線（圖3）可以看出，Chao1指數在0～5000的測序數量范圍內增幅最大，在5000以后曲線斜率下降；從Shannon指數曲線（圖4）可以看出，Shannon指數在0～5000的測序數量范圍內增幅最大，在5000以后曲線斜率下降。3條多樣性指數曲線在測序數量超過一定數量后均趨于平緩，說明測序數據量足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物信息。

2. 3 OTUs數目統計及物種注釋分析

白芨樣品共獲得49550條Tags（過濾后得到的拼接序列數），可分為48個OTUs（97%的序列相似性，下同），包括941條低頻Tags和48609條可以獲得注釋的Tags（圖5）。圖6為白芨樣品中相對豐度排名前8個屬細菌所對應的OTUs的系統發生關系數據，表明白芨內生細菌主要分布于8個屬：地桿菌屬（Pedobacter）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、Kaistobacter屬、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、鹽單胞菌屬（Halomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。從OTUs豐度聚類圖（圖7）可以看出，在屬的分類水平上相對豐度由大到小依次為：鞘脂單胞菌屬>地桿菌屬=鹽單胞菌屬>土壤桿菌屬>Kaistobacter屬=希瓦氏菌屬=假單胞菌屬>短波單胞菌屬。

2. 4 多樣品中特定物種分類樹

從門的分類水平來看，白芨內生細菌分布在擬桿菌門（Bacteroidetes，16.13%）和變形菌門（Proteobacteria，83.87%）；從綱的分類水平來看，白芨內生細菌在Sphingobacteriia綱（16.13%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，54.84%）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，29.03%）中均有分布；從目的分類水平來看，白芨內生細菌在鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales，16.13%）、柄桿菌目（Caulobacterales，3.23%）、根瘤菌目（Rhizobiales，12.90%）、根瘤菌目（Sphingomonadales，38.71%）、交替單胞菌目（Alteromonadales，6.45%）、海洋螺菌目（Oceanospirillales，16.13%）和假單胞菌目（Pseudomonadales，6.45%）中均有分布；從科的分類水平來看，白芨內生細菌在鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae，16.13%）、柄桿菌科（Caulobacteraceae，12.90%）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，38.71%）、希萬氏菌科（Shewanellaceae，6.45%）、鹽單胞菌科（Halomonadaceae，16.13%）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae，6.45%）中均有分布；從屬的分類水平來看，白芨內生細菌在地桿菌屬（Pedobacter，16.13%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas，3.23%）、土壤桿菌屬（Agrobacterium，12.90%）、Kaistobacter屬（6.45%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，32.26%）、希瓦氏菌屬（Shewanella， 6.45%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，16.13%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，6.45%）中均有分布（圖8）。由此可見，鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬為白芨內生細菌的優勢種群。

3 討論

16S rRNA基因很早就應用于微生物種類鑒定，但利用高通量測序進行16S rRNA分析最早出現在2006年，如Sogin等（2006）應用該技術對深海微生物群落進行了分析，隨后該技術在腸道微生物領域得到廣泛應用（南春燕等，2013），但將該技術應用于植物內生微生物的研究未見報道。本研究首次將近幾年迅速發展并成為主流的Illumina MiSeq高通量測序技術應用于植物內生細菌研究，克服了傳統分子生物學方法通量低的缺陷，從基因組的水平上解析微生物群落結構，突破了很多厭氧內生微生物不能被分離培養的技術瓶頸（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999）。16S rRNA位于原核細胞核糖體小亞基上，包括 10個保守區域和9個高變區域，其中保守區在細菌間差異不明顯，高變區具有屬或種的特異性，隨親緣關系不同有一定的差異，因此，16S rDNA作為揭示生物物種的特征核酸序列，被認為是最適于細菌系統發育和分類鑒定的指標。16S rDNA擴增子測序，通常是選擇某個或某幾個變異區域，利用保守區設計通用引物進行PCR擴增，然后對高變區進行測序分析和菌種鑒定，成為研究環境樣品中微生物組成結構的重要手段。但就植物組織而言，葉綠體和線粒體與細菌在系統發育上具有高度的同源性（胡楷和吳慶書，2002），在對白芨內生細菌的16S rDNA-V4變異區序列進行Illumina MiSeq高通量測序后，確實發現部分序列歸屬于宿主葉綠體和線粒體，存在一定比例的宿主污染現象，為了使細菌多樣性的分析結果更加準確、可靠，本研究剔除了宿主葉綠體和線粒體序列。為避開線粒體和葉綠體的干擾，下一步應在不同高通量測序平臺上針對16S rDNA的9個高變區的選擇及組合做更多嘗試，評估樣本的復雜程度及宿主的污染情況，選擇合理的測序區域或設計特異性更高的引物，制定更好的測序策略，從而將高通量測序技術更好地應用于植物內生細菌研究。

目前關于白芨內生細菌多樣性的研究尚無報道，但通過傳統的分離培養方法發現其他植物內生細菌的優勢類群均為芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌（丁雅迪等，2015），與本研究結果不一致。這也從側面反映出植物內生細菌中未培養微生物占很大比例，培養方法分析的細菌僅限于那些能夠在人工培養基上生長的細菌，一些適合于分離培養基營養條件的菌株在分離過程中大量富集，而不適合于分離培養基營養條件的菌株在分離過程中逐漸衰退。許多研究已經證實，通過傳統的分離培養方法鑒定的微生物僅占環境生物總數的0.1%～10.0%（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999），說明通過傳統培養方法得到的結果并不能真實反映內生細菌的多樣性。因此，采用高通量測序的研究方法與傳統的分離培養方法相比，發現的內生細菌種類不但豐富度可能有差別，而且優勢種群也可能不同。已有研究表明，鞘脂單胞菌屬細菌能夠利用的底物廣泛，從多環芳烴類化合物、聚乙烯醇等高聚物到簡單無機物N2+均能利用，某些種屬還能產生有價值的生物高分子（如β-胡蘿卜素、結冷膠）（胡杰等，2007），說明白芨內生細菌可為復雜有機物的降解提供良好的微生物來源。至今，關于鹽單胞菌屬和短波單胞菌屬細菌功能、代謝的研究未見報道，其作為內生細菌的主要類群尚屬首次報道。

盡管高通量測序技術可以克服不可培養的困難，但是該技術也存在弊端，由于測序讀長相比Sanger一代測序短得多，再加上用于序列比對的數據庫目前還不夠完善，使得多數序列均無法被注釋到種的水平，因此，快速、準確及全面的植物內生微生物多樣性研究仍需要多種方法結合來完成。

4 結論

白芨內生細菌主要由地桿菌屬、短波單胞菌屬、土壤桿菌屬、Kaistobacter屬、鞘脂單胞菌屬、希瓦氏菌屬、鹽單胞菌屬和假單胞菌屬等8個屬組成，其中，鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬為優勢種群。采用llumina MiSeq高通量測序技術可以檢測到采用傳統純培養和非培養技術未能發現的低豐度植物內生細菌種類，能準確反映植物內生微生物的種類組成和真實比例，在植物內生微生物研究中具有的明顯優勢和可行性。

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（責任編輯 麻小燕）