對瓜類疫霉菌誘導響應的黃瓜WRKY轉錄因子篩選研究

徐曉美 王瑞 吳廷全 何曉明 林毓娥

摘 要 以黃瓜感病品種‘B80為材料并通過RT-qPCR技術，針對黃瓜全基因組54個CsWRKYs基因，在瓜類疫霉菌侵染后對其進行表達分析，并在水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）處理下對受瓜類疫霉菌誘導（或抑制）基因進行表達檢測，分析其可能參與的抗病相關信號通路。研究結果表明：15個CsWRKYs基因（CsWRKY3、11、13、21、22、23、26、31、34、41、44、46、48、52和56）受瓜類疫霉菌誘導上調表達，僅CsWRKY6受瓜類疫霉菌抑制下調表達。在SA和MeJA處理下，7個CsWRKYs基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）受SA誘導，CsWRKY44同時受SA和MeJA誘導，CsWRKY6受MeJA抑制下調表達，推測 7個基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）可能通過SA介導的信號通路調控植物對病原菌的響應；CsWRKY6可能通過JA介導的信號通路調控植物防御反應過程；CsWRKY44則可能同時參與SA和JA介導的抗病相關信號通路。

關鍵詞 黃瓜；WRKY轉錄因子；疫??；表達分析

中圖分類號 S642.2 文獻標識碼 A

Screening of CsWRKYs Involved in Phytophthora Blight

Resistance in Cucumber（Cucumis sativus）

XU Xiaomei1，2， WANG Rui1，2， WU Tingquan1，2， HE Xiaoming1，2， LIN Yu′e1 *

1 Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China

2 Guangdong Key Lab for New Technology Research of Vegetables， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract By RT-qPCR technology， the expression patterns of 54 CsWRKYs in Phytophthora melonis（P. melonis）-susceptible cucumber cultivar‘B80were analyzed after inoculation with P. melonis and then P. melonis-induced（suppressed）CsWRKYs were analyzed under the treatment of salicylic acid（SA）and methyl jasmonate（MeJA）to investigate their signaling pathways. The results in this study showed that fifteen CsWRKYs（CsWRKY3， 11， 13， 21， 22， 23， 26， 31， 34， 41， 44， 46， 48， 52 and 56）were strongly induced and only CsWRKY6 suppressed by P. melonis. Among them， seven CsWRKYs（CsWRKY26， 34， 41， 46， 48， 52 and 56）were SA-inducible and up-regulated while CsWRKY6 was down-regulated after treatment of MeJA. CsWRKY44 was commonly up-regulated by both SA and MeJA. Based on the results above， we predicted CsWRKY26， 34， 41， 46， 48， 52 and 56 might be involved in Phytophthora blight resistance in cucumber by SA and（or）JA signaling pathway（s）.

Key words Cucumber（Cucumis sativus）； WRKY transcription factor； Phytophthora blight； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.026

黃瓜是一種重要的蔬菜作物，華南地區受高溫高濕氣候條件的影響，黃瓜疫病病害嚴重，但由于高抗疫病材料匱乏，黃瓜抗疫病育種進展緩慢，國內外有關黃瓜疫病抗性遺傳的研究也少有報道，謝大森等[1]認為開展以生物技術為主要手段的抗性轉育研究是當前瓜類疫病抗性育種中的重點。

WRKY轉錄因子起源于早期真核生物并在高等植物中廣泛存在，是植物中最大轉錄因子家族之一[2]，因含有保守的WRKY結構域而得名，該結構域由約60個氨基酸組成，靠近氨基（N）末端的7個保守氨基酸殘基WRKYGQK是該結構域的核心序列[3]。WRKY轉錄因子家族是個龐大的基因家族。目前，水稻中已鑒定了至少有109個WRKY成員[4]，擬南芥74個[5]，玉米136個[6]，大豆133個[7]，大白菜145個[8]。最早鑒定的WRKY轉錄因子SPF1存在于甘薯中，其生物學功能是調控糖信號途徑的建立[9]。隨后大量研究表明WRKY轉錄因子在植物對生物和非生物脅迫防御反應中發揮至關重要的調控作用，同時也參與植物花粉發育[10]、種子成熟和萌發[11]、植株葉片衰老[12]等生理過程。在植物應對生物脅迫反應中，WRKY轉錄因子基因主要參與了植物從基礎免疫到獲得抗性的多種抗病反應過程，通過調控多通路多層次的抗病信號轉導途徑影響植物對病原物的生理反應，在植物與病毒、細菌、真菌、線蟲以及昆蟲的相互作用過程中發揮重要作用[13]。Dong等[14]對72個擬南芥WRKY基因的表達譜進行分析，發現其中有49個基因受含無毒基因的病原菌或SA的誘導。在水稻中，45個被檢測的WRKY基因中有15個受稻瘟菌誘導后顯著表達上調，并且其中12個同時受白葉枯病菌不同程度誘導表達，信號通路檢測發現，OsWRKY45和OsWRKY62受SA誘導表達上調；OsWRKY10、OsWRKY82和OsWRKY85受JA誘導上調；OsWRKY30和OsWRKY83同時響應SA和JA上調表達[15]。除擬南芥和水稻等模式植物外，隨后的研究發現在棉花[16]、油菜[17]、大麥[18]等大宗作物和辣椒[19-20]、大白菜[8]等蔬菜作物中均有發現WRKY轉錄因子響應病原菌誘導反應。

隨著黃瓜基因組測序的完成，Ling等[21]對黃瓜基因組進行搜尋后找到55個CsWRKY轉錄因子基因，并對55個基因在冷、旱和高鹽脅迫下進行表達分析。目前，國內外尚未見WRKY轉錄因子參與黃瓜抗病反應的報道，本研究利用RT-qPCR技術，旨在對黃瓜CsWRKYs基因在瓜類疫霉菌處理下進行表達分析，篩選出抗病相關CsWRKYs基因并分析其可能參與的抗病相關信號通路，為研究CsWRKYs參與黃瓜疫病防御反應的分子功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物材料為華北型黃瓜品種‘B80（感病材料），該材料為本實驗室經多年選育獲得的高代自交系。供試瓜類疫霉菌株為HNG5，為本實驗室從廣東省廣州市白云實驗基地黃瓜病株上分離并純化獲得。

1.2 方法

1.2.1 植物培養和接菌處理 植物材料種植：供試材料‘B80均在育苗杯中育苗，種植10杯，每杯播種5～6顆種子，置于人工氣候箱（RTOP-1000Y）培養。培養條件為：28 ℃ 10 h光照和24 ℃ 14 h黑暗交替，濕度為85%。10 d苗期的黃瓜幼苗將用于接菌處理。

瓜類疫霉菌培養及誘孢：將分離保存的HNG5疫霉菌切一小塊放于V8固體培養基（200 mL V8 果蔬汁，3.0 g CaCO3，20 g瓊脂，800 mL無菌水，調pH值至6.3）并置于25 ℃黑暗環境下培養4 d，后將菌斑切成0.5 cm見方的小塊，置于滅菌的三角瓶或組培瓶中（10個小塊/瓶），加V8液體培養基至液面稍低于菌斑的高度，并每隔12 h換一次滅菌水，換水3 d即可誘孢：將培養瓶放于4 ℃冰箱15 min，后室溫放30 min，即有大量孢子產生。用血球計數板計數游動孢子數量，調節至游動孢子濃度為5×103個/mL用于灌根接種黃瓜幼苗。

接種處理：接種前12 h將待接種幼苗澆透水，用量筒量取50 mL孢子懸浮液，小心灌入育苗杯內，同時以蒸餾水處理作對照，分別在處理后0、24、48和72 h 取幼苗根莖部固定于液氮中，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 SA和MeJA處理 供試植株‘B80培養同上，在二葉一心幼苗期分別以5 mmol/L的SA和100 μmol/L的MeJA溶液（均溶解于10%的乙醇溶液中）噴灑幼苗葉片，以噴灑10%濃度的乙醇溶液為對照，分別在噴灑后0、12和24 h取植株根部以上部分固定于液氮中，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 RNA提取和反轉錄 取-80 ℃冰箱中保存的單株樣品，利用RNAiso Plus（Takara）提取其總mRNA，對mRNA樣品進行DNaseⅠ處理（37 ℃，30 min）后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用NanoDrop 2000測定其濃度，確定mRNA質量合格后用于反轉錄反應。按照熒光定量PCR（RT-qPCR）專用反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）操作說明合成第1鏈cDNA，稀釋10倍后用作RT-qPCR反應模板。

1.2.4 引物設計和RT-qPCR基因表達分析 根據Ling等[21]提供的黃瓜WRKY基因注釋號在黃瓜基因組數據庫（http：//cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）查找基因序列，按照RT-qPCR引物設計要求，利用引物設計軟件Primer Premier 6.0設計引物并交由上海生工合成，引物經過檢測合格后用于后續RT-qPCR反應。

RT-qPCR的操作均參照熒光定量試劑盒說明書（SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ，Takara）進行，略有改動。反應體系10 μL：SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）5 μL，上游和下游引物各1 μL，cDNA模板2.5 μL，無菌水0.5 μL，每個樣品設3次重復。反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環。內參基因為Cs-UBQ，RT-qPCR反應均在BIO-RAD CFX96（Bio-Rad，USA）熒光定量PCR儀上進行。

1.3 數據處理和分析

RT-qPCR數據采用Microsoft Office Excel 2007進行整理分析，ct值>33.0時認為數據不可靠，不予進行后續計算和分析，基因相對表達量的計算方法采用2-△Ct法[22]。接菌處理下基因上調（下調）表達倍數計算方法：Ft=（Pt-P0）/P0-（Wt-W0）/W0。Ft表示接菌處理后某時間點基因上調或下調表達倍數，即分別指24、48和72 h的3個時間點；Pt表示接菌處理后某時間點基因相對表達量；P0表示接菌處理后0 h基因相對表達量；Wt表示對照處理，即水處理后某時間點基因相對表達量；W0表示對照處理后0 h基因相對表達量，本研究中P0=W0。∣Ft∣≥2時，該基因被認為受瓜類疫霉誘導（抑制）。SA（MeJA）處理下基因上調（下調）表達倍數計算方法同前，時間點為處理后12和24 h，時間較短，因此，∣Ft∣≥1時，該基因被認為受該外源激素誘導（抑制）。

2 結果與分析

2.1 RT-qPCR引物設計及篩選

本研究針對黃瓜全基因組55個CsWRKYs進行引物設計合成，每對引物均通過RT-qPCR反應檢測引物特異性、擴增效率和是否存在引物二聚體，經過多次設計、篩選后，除CsWRKY55以外，其它54個CsWRKYs均篩選到適用于RT-qPCR的引物（表1）。

2.2 瓜類疫霉處理下CsWRKYs基因表達分析

本研究對黃瓜全基因組54個CsWRKYs基因在瓜類疫霉處理后0、24、48和72 h進行表達分析。內參基因CsUBQ在瓜類疫霉處理后0、24、48和72 h樣品中的ct值范圍分別為19.37～21.42、19.97～22.55、18.71～21.39和18.40～22.70，在此條件下，待檢測CsWRKYs的ct值>33.0，則該CsRKYs基因被認為表達量極低，數據不可靠，不參與后續分析。

CsWRKYs基因表達分析結果表明：黃瓜CsWRKYs基因表達水平普遍較低，在被檢測樣品中均低于內參基因CsUBQ的表達水平，其中8個CsWRKYs基因（CsWRKY9、20、28、30、35、36、38和39）表達水平極低，在個別樣品中檢測到ct>33.0，不予進行后續分析。剩余46個CsWRKYs基因數據處理分析結果顯示如圖1：有15個CsWRKYs基因（CsWRKY3、11、13、21、22、23、26、31、34、41、44、46、48、52和56）受瓜類疫霉菌誘導，表現出現2倍以上的上調表達，受誘導最強基因為CsWRKY44，上調表達量高達361倍。另外，CsWRKY13、26 、41和56受疫霉菌誘導也較強，基因上調表達量均在10倍以上。在15個受誘導表達基因中，11個基因（CsWRKY11、13、22、26、34、41、44、46、48、52和56）在接菌處理后72 h表達量達到最高；3個基因（CsWRKY21、23和31）在接菌處理后48 h表達量達到最高；只有1個基因（CsWRKY3）在接菌處理后24 h表達量達到最高。46個基因中只有CsWRKY6受瓜類疫霉菌抑制，在接菌處理后72 h基因下調表達量達3.2倍。

2.3 SA和MeJA處理下CsWRKYs基因表達分析

在接種瓜類疫霉處理后發現，被檢測的46個CsWRKYs基因中有16個受瓜類疫霉誘導表達，同時發現有1個CsWRKYs基因表達受到抑制，推測這16個CsWRKYs基因有可能參與黃瓜抗疫病反應。為檢測其抗病相關信號通路，本研究在外源激素SA處理下分別對這16個基因進行表達分析，結果如圖2-A所示：16個基因中除CsWRKY6表達下調外，其它15個基因的表達量均有不同程度上調，且12個基因（CsWRKY3、11、13、CsWRKY21、22、23、26、31、34、41、44和46）均在SA處理后12 h表達量達到最高，隨后有下降趨勢，另外3個基因（CsWRKY48、52和56）在SA處理后表達逐漸上調，在24 h達到最高。15個表達上調基因中有8個CsWRKYs基因（CsWRKY26、34、41、44、46、48、52和56）上調表達量達1倍以上，其中CsWRKY44上調表達量最高，達9倍有余，這8個基因被認為極有可能與黃瓜抗疫病相關，并參與SA介導的抗病相關信號通路。本研究同時在外源激素MeJA處理下分別對這16個基因進行表達分析，如圖2-B所示：在MeJA處理下，16個基因中只有CsWRKY6的下調表達量和CsWRKY44的上調表達量達1倍以上，部分基因（如CsWRKY3、13和21等）的表達量呈現小幅上調或下調，還有另一部分基因（如CsWRKY11、22和23）的表達量幾乎不變。綜上研究結果推測：16個受瓜類疫霉菌誘導（抑制）的基因中，9個基因（CsWRKY6、26、34、41、46、44、48、52和56）極有可能與黃瓜抗疫病相關，其中，7個基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）有可能通過SA介導的抗病相關信號通路調控植物對病原菌的響應；CsWRKY6可能通過JA介導的信號通路調控植物防御反應過程；CsWRKY44則可能同時參與SA和JA介導的抗病相關信號通路。

3 討論與結論

Ling等[21]研究證實，在黃瓜中有23個CsWRKYs基因對冷、旱和高鹽至少一種脅迫有響應，表現為脅迫處理后基因表達量呈顯著差異，且該研究表明，在應對非生物脅迫時，黃瓜和擬南芥中同源WRKY轉錄因子基因的反應存在相關性。本研究篩選出15個受瓜類疫霉誘導和1個受瓜類疫霉抑制的CsWRKYs基因，其中7個基因（CsWRKY21、26、31、34、41、46和48）在擬南芥中均存在其同源基因[21]。已有的研究報道中，CsWRKY34的同源基因，即AtWRKY70，是RPP4介導抗性和對霜霉病菌基礎性抗性的重要成員，在霜霉病菌誘導的抗性防御途徑中調控活性氧中間體的產生和SA的積累[23]。CsWRKY46的同源基因AtWRKY8，受馬鈴薯晚疫病菌誘導，同時通過SA途徑負調控對丁香假單胞菌的基礎抗性并通過JA途徑正調控對灰葡萄孢菌的抗性[24]。本研究推測，在應對生物脅迫反應中，黃瓜和擬南芥中同源WRKY轉錄因子基因也可能存在功能相關性。

WRKY是最重要的受病原體和SA誘導的轉錄因子基因，在調節水楊酸依賴基因的表達過程中發揮重要作用。Dong等[14]對72個擬南芥WRKY轉錄因子基因進行表達譜分析，發現其中有49個基因受含無毒基因的病原菌或SA誘導。本研究中，54個被檢測的黃瓜CsWRKYs基因中有15個基因受瓜類疫霉菌誘導上調表達，其中8個基因同時受SA誘導，該結果與前人的認識較為一致。

SA和JA是2種常見的介導植物抗病反應的信號分子，前人研究表明，SA和JA介導的植物抗病反應途徑并非相互獨立，通常認為，兩者是相互拮抗的[25]。擬南芥中，AtWRKY62基因受SA誘導，同時在抑制JA反應中發揮作用，Atwrky62突變體中JA響應基因表達增強，而AtWRKY62過量表達時JA響應基因的表達量降低[26]。水稻中，過量表達OsWRKY13能提高水稻對白葉枯病菌和稻瘟病菌的抗性，該過程是通過激活SA的生物合成和SA響應基因同時抑制JA信號途徑來調控[27-28]。除此以外，兩者之間的協同作用也有報道。在水稻中，OsWRKY30和OsWRKY83均受SA和JA誘導上調表達[15，29]。本研究中，CsWRKY44同時受SA和MeJA誘導上調表達，暗示CsWRKY44可能同時參與SA和JA介導的防御反應信號通路，處于2條通路的節點上。然而，防御反應調控是一個復雜過程，CsWRKY44是否真正協同調控SA和JA介導的信號通路還有待進一步研究。

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