花生ABI3基因的克隆、序列分析及表達載體構建

王云云 孫全喜 王秀貞 唐月異 吳琪 張青云 曹廣英 祁雪 張君 王傳堂

摘要：脫落酸（ABA）作為植物體內的一種重要激素，參與植物多個生長發育過程。ABI3是ABA信號轉導途徑中的關鍵基因。本研究采用RT-PCR技術從花生成熟種子中克隆到ABI3的同源基因AhABI3。預測該基因開放閱讀框為2313 bp，編碼770個氨基酸。同源比較發現AhABI3與擬南芥、鷹嘴豆等的ABI3具有較高的相似性；進化分析表明AhABI3與鷹嘴豆ABI3親緣關系最近。本研究還成功構建了AhABI3的過量表達載體pCambia2300EC-AhABI3，為進一步研究其功能奠定了基礎。

關鍵詞：花生；AhABI3；進化樹分析；氨基酸比對；植物表達載體構建

中圖分類號：S565.201

文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）02-0001-06

花生（Arachis hypogaea L.）是一種豆科植物，其種植面積排在稻谷、小麥、玉米、大豆、油菜和甘薯之后，列第七位，在油料作物中，其種植面積僅次于油菜?；ㄉ鳛槲覈匾挠土虾徒洕魑铮谟土仙a和國際貿易中占有舉足輕重的地位，與油菜、芝麻、向日葵等油料作物相比，花生的單產、總產量和出口量均居首位。

脫落酸（ABA）作為植物體內的一種重要激素，參與植物多個生長發育過程，如抑制種子萌發、促進休眠、抑制生長、促進葉片衰老脫落等。ABI3基因是ABA信號轉導途徑中的關鍵基因，在調節種子成熟、萌發等生長過程中起著重要作用。

擬南芥ABI3在種子成熟過程中起著主要調節作用。玉米VP1基因與擬南芥ABI3基因在氨基酸序列水平上有較高的相似性，它能使種子早熟，抑制胚胎和糊粉層中花青素積累。ABI3/VP1的同源基因也已在其他植物中發現，如水稻、菜豆、燕麥、胡蘿卜、白楊等，這些基因編碼的蛋白序列的高度保守性表明該轉錄因子家族在調控開花植物的胚成熟過程中發揮著極其重要的作用。Giraudat等對ABI3和VP1蛋白序列的分析發現了3個高度保守區域，從氨基端分別命名為B1、B2和B3。從玉米VPI中分離出其B3結構域，發現它在體外可以與C1基因啟動子上的Sph基序（含有RY元件）特異性地結合。郭曉芳等通過Northern雜交技術檢測到ABI3同源基因在花生種子的子葉和胚中表達，但是沒有對該基因進行克隆。

本研究從花生“X-166”成熟種子中克隆到AB13的同源基因AhABI3，經同源比對和進化樹分析，AhABI3與來自其它物種的ABI3有較高的同源性；構建了AhABI3的過量表達載體pCam-bia2300EC-AhABI3，旨在研究該基因在花生中的作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料及載體

試驗所用“X-166”花生種子由山東省花生研究所提供；植物表達載體pCambia2300EC（添加了35S啟動子以及Tnos終止子的pCambia2300載體）由山東農業大學元寶秀教授饋贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 AhAB13基因序列的獲得及PCR擴增 利用擬南芥ABI3 mRNA序列（GenBank登錄號：NC_003074.8）在花生基因組數據庫（http：//www.peanutbase.org）中進行BLAST，獲得可能的花生AhABI3序列（PU48P.1）。根據預測基因的開放閱讀框（ORF），用DNAClub設計引物F1、R1（表1）。

提取花生種子總RNA，用ReverAid FirstStrand cDNA Svnthesis Kit（Fermentas）試劑盒進行反轉錄獲得單鏈cDNA，利用引物F1、R1對該基因的開放閱讀框進行擴增。PCR反應體系：5×HF Buffer 10 μL， dNTP Mix（10 mmol/L）2μL，引物F1 2μL，引物R1 2μL，DMS0 0.6μL，高保真酶Phusion（New England Labs）0.2μL，模板1μL，ddH₂O32.2μL。PCR反應程序：98℃預變性30s；98℃變性10s，58℃退火10s，72℃延伸1min，循環30次；72℃后延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳結束后，切取含目的條帶的凝膠，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收PCR產物。將回收產物與pEASY-Blunt simple載體（北京全式金）連接、熱激法轉化大腸桿菌DH5a（北京全式金），取陽性克隆送上海桑尼生物科技有限公司測序，將測序正確的克隆命名為pEASY-AhABI3-1。

1.2.2 AhABI3基因序列和氨基酸序列分析 基因開放閱讀框、氨基酸序列比對由DNAMAN序列分析軟件（Lvnnon Biosoft）完成。

1.2.3 系統發育樹的構建將AhABI3編碼的氨基酸序列與來自其它物種的ABI3氨基酸序列進行比對分析，并使用DNAMAN軟件構建系統發育樹。

1.2.4 植物過量表達載體的構建 參照質粒小提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明步驟，提取pEASY-AhABI3-1和pCambia2300EC質粒。用DNAClub設計含Kpn I（Fermentas）和Sac I（Fermentas）酶切位點的引物F2、R2（表1），對pEASY-AhABI3-1質粒稀釋物進行PCR擴增。得到的片段連接克隆載體pEASY-bluntsimple后，得到質粒pEASY-AhAB13-2，利用Kpn I和Sac 1分別對其和植物表達載體pCam-bia2300EC進行雙酶切，回收目的片段，使用連接酶Solution I（大連寶生物）16℃過夜連接，轉化大腸桿菌感受態DH5a，挑取單菌落進行PCR和酶切鑒定并測序，獲得帶有AhABI3的植物表達載體pCambia2300EC-AhABI3.

2 結果與分析

2.1 花生總RNA的提取

將提取的花生種子RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），可見28S和18S條帶清晰完整，表明所提RNA質量較好，可用于下一步試驗。

2.2 AhABI3基因的克隆

以RNA反轉錄所得cDNA為模板，利用設計的引物F1、R1進行PCR擴增，獲得大小約為2300 bp的片段（圖2），與預期結果一致。將測序結果利用DNAMAN軟件分析得到長度為2313bp的ORF，編碼770個氨基酸（圖3）。

2.3 AhABI3氨基酸序列分析

將推導的AhABI3氨基酸序列與來自其它5個物種的ABI3氨基酸序列進行比對，并構建系統發育樹。序列比對結果顯示AhABI3與鷹嘴豆ABI3序列的同源度較高，與擬南芥等其它物種的ABI3存在一定的同源性，其中，B3結構域有很高的相似性（圖4）。由此推斷，AhABI3應為ABI3的同源基因。系統發育樹結果顯示AhABI3與鷹嘴豆ABI3親緣關系較近（圖5）。

2.4 AhABI3基因植物表達載體構建

對帶有目的基因片段的克隆載體pEASY-AhABI3-2和植物表達載體pCambia2300EC同時用Kpn I和Sac I進行雙酶切，酶切結果見圖6，回收目的片段以及載體片段，連接后，轉化大腸桿菌DH5a，經菌液PCR后，挑取陽性克隆測序，測序結果表明AhABI3片段已準確插入到植物表達載體pCambia2300EC上，載體結構見圖7。

3 討論

種子休眠的建立與維持與脫落酸ABA密切相關。在野生型擬南芥種子中，ABA的累積誘導種子進入休眠，并維持休眠狀態。ABA不敏感突變體（abil和abi2）種子表現為輕度休眠，在萌發過程中對ABA抑制萌發的敏感性降低；而ABA敏感性增強突變體表現為抑制種子萌發所需ABA量的降低。這表明對于維持種子的休眠性，種子中ABA含量以及對ABA的敏感性均起著重要作用。

ABA生物合成基因的過量表達會使種子中ABA含量增加，從而促進種子休眠或延遲萌發。陳靜等研究顯示，休眠花生種子在吸脹過程中，為了維持種子休眠性，ABA合成關鍵基因AhNCED2的表達量增加，吸脹18h時達到峰值，隨即開始下降。ABI3轉錄因子在ABA信號轉導途徑中是必不可少的，這暗示AhABI3基因可能與花生種子休眠有關。本研究克隆得到AhABI3基因，經生物信息學分析，認為其是ABI3基因的同源基因，并成功構建了植物過表達載體pCambia2300EC-AhABI3，為進一步研究AhABI3基因的功能奠定了基礎。