影響烤煙綠原酸含量因素的研究進展

田阿林　周文康　溫圣賢

摘 要：綠原酸是煙葉中最主要的酚類物質，與烤煙的色澤、香氣及質量密切相關。該文以綠原酸的遺傳研究現狀作為出發點，圍繞生態、栽培和調制3個方面對影響煙草綠原酸含量的因素進行了分析，為有目的地改善煙葉香氣品質、外觀質量和服務生產實際提供理論依據。

關鍵詞：烤煙；綠原酸；轉基因調控；生態因素；栽培措施；調制技術

中圖分類號 S572 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）17-0022-05

Abstract：Chlorogenic acid is the most important tobacco phenolics， closely related to the color， aroma and quality of tobacco. In this paper，status of genetic research chlorogenic acid as the starting point，and surrounding ecology，cultivation and modulation three aspects of factors affecting tobacco chlorogenic acid content were analyzed to provide theoretical basis for purposefully improving tobacco aroma quality，appearance，quality and service production.

Key words：Flue-cured tobacco；Chlorogenic acid；Transgene regulation；Ecological factors；Cultivation measures；Modulation techniques

煙葉中綠原酸含量占總多酚的75%～95%，在烤煙中含有3%或更高的綠原酸，是煙葉中含量最高的多酚化合物。綠原酸是產生煙草香氣的重要成分之一，不僅直接影響煙葉顏色，而且對煙氣質量和香吃味也有間接影響，其降解產物還可以改善煙草制品的吸味，是衡量煙葉品質的重要指標[1]。提高煙草中綠原酸的含量，可以提高煙草的香氣質、香氣量及透發性，降低刺激性[2]，且綠原酸的含量與煙葉等級是相一致的，綠原酸含量越高，煙草制品等級也就越高。綠原酸在煙草行業中有重要應用，并且已經廣泛應用于食品、保健、醫藥、日常生化用品等領域[3]。目前，國內外圍繞著煙草綠原酸已經進行了大量研究，但多是與其他酚類物質結合在一起來分析，很少有單獨將綠原酸作為一個研究主體來討論的。筆者基于已開展的針對綠原酸的研究資料，系統地分析了綠原酸的積累在烤煙基因型間的不同及基因調控，并闡述了生態條件、栽培措施和調制技術等因素對烤煙綠原酸含量的影響，以期為煙葉品質的提高和特色優質煙葉的開發研究提供有益的參考。

1 遺傳因素對烤煙綠原酸含量的影響

1.1 烤煙基因型差異 煙草綠原酸有著定量的遺傳差異，含綠原酸高的煙草品種，其后代的綠原酸含量也較高，反之亦然[4]。這說明煙草中綠原酸含量是受遺傳基因控制的，品種間綠原酸水平的差異能夠傳遞給后代，因此可以通過育種途徑來選育綠原酸含量適宜的煙草品種。不同基因型間相比，多酚物質絕對含量的最高值是最低值的2～3倍，綠原酸相對含量最高值比最低值高20個百分點[5]。對河南中部煙區種植的4個烤煙品種初烤煙葉中的多酚成分進行了測定，發現中煙100的多酚總量、總綠原酸、綠原酸含量顯著高于NC89、云煙85和云煙87，NC89次之，云煙85和云煙87的相對較低[6]；山東諸城、四川西昌兩產區中烤煙總綠原酸含量均高于平均值的品種有NC89、凈葉黃、中煙102、中煙98、云煙87、中煙14、單育2號、革新三號、09-53等，可作為高綠原酸含量親本在育種中利用[5]。綠原酸的含量除了在不同基因型烤煙整體間存在差異外，在其不同部位間也有較大差異，表現為下部葉（X2F）>中部葉（C3F）>上部葉（B2F），而4-O-咖啡喹尼酸和新綠原酸為中部葉（C3F）≥下部葉（X2F）>上部葉（B2F）[7]。綠原酸含量不僅在煙株不同部位葉片中存在著一定的差異，而且同一片煙葉中綠原酸的分布也呈現一定的規律性，綠原酸含量從尖端到基部逐漸降低，尖端的綠原酸含量為基部的2倍[8]。

1.2 轉基因調控 隨著對綠原酸生物合成途徑的深入了解，通過轉基因技術可增加煙草體內綠原酸的積累。煙草中過量表達tobHQT基因，煙草葉片中綠原酸的含量提高了10%以上，而且在過量表達tobHQT的轉基因煙草中抗氧化脅迫和抗病毒能力有顯著的提高[9]。朝鮮薊中的HQT1基因在本明煙中瞬時過量表達，轉基因煙草葉片中的綠原酸含量提高了大約3倍，朝鮮薊中HQT1在普通煙草中穩定過量表達，能使煙草葉片中的綠原酸含量提高10倍以上[10]。研究表明[11]，與野生型相比，轉NtC3H基因的煙草葉片中綠原酸的含量最高提高了3.6倍，最高含量達到1 167.1μg/g（鮮重）。這種變化很可能是由于對-香豆酸3-羥化酶（C3H）在次生代謝途徑中起到的作用不僅僅是調節木質素的合成過程，也同時對綠原酸所在的合成途徑中其他相關酶的表達產生了影響，促進其在煙草植株體內的累積[11]。說明C3H可能并不是直接催化生成綠原酸，而是合成過程的中間酶。

2 生態環境因素對烤煙綠原酸含量的影響

生態、品種及其互作對烤煙綠原酸含量變異的貢獻率不同，生態對三者含量變異的貢獻率分別為47%、18%、35%[12]。生態條件、生態與品種和栽培措施互作效應是影響烤煙綠原酸含量的關鍵因素，品種和栽培措施對綠原酸的含量亦有重要作用[13]，但環境因素對綠原酸累積的影響大明顯于遺傳因素[14]。

2.1 光照 光周期對煙草不同器官內綠原酸的積累有重要作用，光照能誘導煙草體內綠原酸合成代謝水平的上升。光對煙草體內綠原酸含量的影響是通過光敏色素來控制的。生長在冬季光照充足條件下的葉片中綠原酸含量較背陰條件下明顯增高；夏季葉片中的綠原酸含量則比冬季增高一倍[15]。同一品種的煙草生長在溫室中，由于溫室中光照強度弱，綠原酸含量減少，補充短波紫外光時，煙葉綠原酸含量顯著提高[16]。Tso等[17]研究表明，添加遠紅外光對增加煙葉內的綠原酸含量的促進作用尤為顯著。成熟期烤煙上部葉施加UV-B（波長為280～320nm）能促進煙葉多酚含量的提高，增幅與UV-B強度成正比，但會抑制中部葉的綠原酸和蕓香苷的合成，且降幅與UV-B強度成正比，隨著UV-B強度增加煙葉綠原酸含量呈曲線下降趨勢[18]。這可能與中部葉受到的UV-B強度弱于上部葉，多酚氧化酶和過氧化物酶含量升高，導致多酚氧化分解所致。由此看來紫外光在煙草綠原酸合成與積累過程中可能起關鍵作用。光照強度與烤煙的多酚（綠原酸和蕓香苷）含量成正相關[18]。適度遮陰有利于紅花大金元和中煙100的上部葉綠原酸合成，不利于K326上部葉綠原酸的合成；有利于紅花大金元中部葉的綠原酸合成，不利于中煙100和K326上部葉綠原酸的合成；遮陰對于下部葉成熟期綠原酸的合成均有不良影響，并且一定范圍內光強越低，綠原酸含量越少[19]。通過不同的LED獲得單色光，對生長中的煙草進行光質處理，與白光相比，紫、藍光促進了煙葉內的綠原酸合成和積累[20]。這與紫、藍光處理促進了苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性增強，降低了過氧化物酶（POD）活性在某種程度上有一定的關系。

2.2 溫度 煙草綠原酸含量的變化也與煙株的受寒溫度有關，受過驟寒的煙株與對照煙株相比，除了根部以外部位的綠原酸濃度增大了4～5倍[21]，這可能是煙草抵御寒冷的應激反應。煙草成熟期以前，煙葉中總酚含量持續下降，但移栽-團棵期時較低溫度（均溫16℃）下的總酚含量維持在一個相對較高的水平，而到了團棵-現蕾期，較高的溫度（均溫25℃）更有利于總酚含量的維持；進入成熟期后，煙葉中的總酚含量開始逐漸升高，且較高的溫度下的總酚積累量最多[22]。而在低溫脅迫下，總酚含量持續降低[23]。因此，煙草生長期間前期稍低后期較高的氣溫條件更有利于多酚物質的積累，而前期高后期低的氣溫條件則不利于多酚物質的積累。

2.3 水分 綠原酸能夠緩解逆境脅迫引起的膜脂過氧化，減少細胞膜損傷，從而可以保護細胞膜和細胞壁。干旱脅迫早期，總酚和木質素的積累量明顯升高，在24h時達最大值，之后隨脅迫時間的延長逐漸降低[24]。但干旱脅迫可能不會上調綠原酸含量，因為ABA是調節干旱脅迫和鹽脅迫的重要激素，而ABA沒有明顯上調綠原酸合成關鍵基因NtHQT1的表達[25]。

2.4 海拔 生長在高海拔地區的煙草綠原酸含量比生長在低海拔地區的高，這與紫外輻射較強有關。河南、山東、陜西、安徽、廣東、湖南、江西、廣西8省區的濃香型烤煙主產區范圍內（海拔高度17～1 298m），綠原酸占多酚含量的比例與海拔高度成負相關和極顯著負相關，且華中地區（海拔高度64～1 044m）烤煙綠原酸占多酚含量的比例與海拔高度成極顯著和顯著負相關[26]。李軍營等[27]研究指出，綠原酸與海拔高度間的相關性沒有達到顯著水平，但多酚物質總量隨海拔升高顯著增加[28]，因此海拔可能對除綠原酸外的主要多酚類物質存在影響。目前，一些研究認為，綠原酸與海拔高度呈顯著或極顯著負相關[29]。而另一些研究則認為，高海拔有利于提高煙葉中除綠原酸外其他物質的含量[30]。導致這種差異的原因可能是因為海拔高度對綠原酸含量的影響存在閾值效應，且供試品種對海拔高度的敏感程度不同。

3 栽培措施對烤煙綠原酸含量的影響

3.1 礦質營養 礦質元素的不平衡會影響綠原酸在煙株中的積累，增加氮肥施用量是否促進綠原酸的積累尚存在爭議[31-32]。但煙草成熟中后期，適當增加硝態氮比例，能明顯提高綠原酸含量，改善烤煙煙葉香氣風格[33]。磷肥的施用量增加，煙葉中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭的含量也增加，增施鉀肥對多酚類化合物含量影響較小[16]。但分次施鉀肥能夠提高煙葉總酚、綠原酸含量[34]。主要營養元素缺乏會對烤煙主要香氣前體物造成嚴重影響，缺N、缺K、缺P、缺Mg對綠原酸合成代謝極為不利，缺P抑制煙葉綠原酸合成代謝影響最大，缺Mg、缺K其次，缺N影響最小[35]，缺Ca的煙葉中綠原酸含量低。但缺B可以導致煙株體內積累大量酚酸[36]。因此，在烤煙生產中后期保持N、P、K、Mg、Ca的合理供應，進一步研究平衡施肥，對提高烤煙香氣量和煙葉品質至關重要。鹽脅迫對烤煙綠原酸含量也存在影響。適度NaCl（350mmol/L）脅迫處理下鮮煙葉綠原酸等多酚物質含量增加，且與PAL活性變化密切相關，但過度（700mmol/L）脅迫增幅較小，可能因為嚴重的脅迫會將綠原酸氧化形成其他物質[37]。

3.2 有機質 土壤有機質對烤煙品質形成有重要影響，能較好地改善煙葉內在品質。煙葉綠原酸含量隨土壤有機質含量增加呈先升高后降低的趨勢，但差異不顯著，而煙葉多酚總量隨土壤有機質含量增加遞增，高有機質組的煙葉多酚總量顯著高于低有機質組（P<0.05）[44]。這可能是因為土壤有機質主要影響莨菪亭和蕓香苷含量[38]。趙銘欽等[39]的研究表明，增施有機質可以使煙葉中綠原酸含量明顯增加，以增施發酵后的豆漿最好，其次是增施豆參，而增施芝麻和香油的效果較差。

3.3 植物生長調節劑 植物生長調節劑對煙草綠原酸的合成及積累有很大影響，噴施萘乙酸（NAA）可降低綠原酸含量。茉莉酸甲酯（MeJA）、生長素（IAA）、獨角金內酯類似物（GR24）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和赤霉素（GA）能明顯上調NtHQT1基因的表達，脫落酸（ABA）對基因表達沒有明顯作用[25]。因此，推測MeJA、IAA、GR24、6-BA和GA能夠上調綠原酸含量。打頂后涂抹IAA可以降低煙葉中多酚類化合物含量，降低程度與涂抹次數有關[40]。目前，關于IAA、NAA、GA等植物生長調節劑的適宜濃度、作用時期及作用機制仍需進一步深入系統的研究[41]。

3.4 成熟度 隨著生育期延長，烤煙綠原酸含量逐漸增加，成熟期時達到最高值。中、上部初烤煙葉多酚中綠原酸比例隨采收成熟度的提高而增加，達到過熟時略有降低[42]。只有采收適熟煙葉，才能保持煙葉內有適宜綠原酸含量。煙葉延后采收，葉片柵欄組織厚度、海綿組織厚度和組織比等參數呈下降趨勢，細胞間隙呈逐漸增大趨勢，葉肉細胞出現逐漸解體現象[43]。而柵欄組織、海綿組織都含有相當豐富的綠原酸，且柵欄細胞綠原酸含量高于海綿細胞含量[44]。因此，延遲采收可能會降低煙葉中綠原酸的含量。不同品種的基因差異以及生態適應性是造成葉片結構差異的主要因素[44]，在育種和栽培上培育柵欄細胞適度發達的品種，有利于提高綠原酸含量，從而改善了煙葉品質。

3.5 裝煙方式 煙篦烤煙的總酚、綠原酸含量最高，煙夾烤煙次之，煙筐烤煙的最低，且有顯著性的差異（P<0.05）；3種裝煙方式的抗氧化能力順序（DPPH自由基清除能力和還原能力）與總酚含量和綠原酸含量之間存在一定的正相關性[45]。從煙葉品質和抗氧化能力考慮，煙篦裝煙是比較好的選擇[45]。

3.6 其他因素 不同栽培模式、種植密度及留葉數均對對煙草綠原酸含量存在影響，地膜覆蓋栽培[46]、低起壟2次培土成壟[34]及合理的種植密度和留葉數[47]有利于提高促進煙草綠原酸的合成，進而改善煙葉質量。另外，還發現一些病原菌侵染能提高植物綠原酸含量，當煙草遭受根串珠霉菌侵染時根和葉中的綠原酸含量明顯增高[48]。這可能與綠原酸能提高植物的抗病性有關。

4 調制技術對烤煙綠原酸含量的影響

4.1 烘烤 烘烤過程中煙葉綠原酸形成有相當大的數量，與新鮮煙葉相比，烘烤后綠原酸的含量增加約9倍之多。煙葉密集烘烤前對鮮煙葉正面煙梗劃開和煙葉背面煙梗剔除，烘烤過程中苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性呈上升趨勢[49]，這有利于綠原酸的合成。與普通烤房相比，密集烘烤過程中多酚氧化酶活性較低，總酚、綠原酸和新綠原酸的含量較高，說明密集烘烤烤后煙葉趨于變黃充分，不易發生棕色化反應，有利于煙葉烤黃[50]。為了改善和提高密集烘烤煙葉質量，有研究指出，“8點式精準工藝”有利于多酚糖苷和酯的分解代謝，促進多酚的積累，為非酶棕色化反應和煙葉香氣的形成提供了必要的前體物質，而且棕色化反應適度，對烤后煙葉的顏色有利[51]。定色前期是烤煙煙葉多酚含量最容易減少的時期，一旦烘烤不當，綠原酸等就會在多酚氧化酶的作用下被氧化為醌，然后與氨基酸、糖類等結合成為深色色素，對煙葉顏色和香味造成不利影響。定色前期以44℃為穩溫點時，烤后煙葉中的綠原酸和總酚含量含量較低，而以46、48℃作為穩溫點時，烤后煙葉中的綠原酸和總酚含量含量較高[52]。究其原因，可能是在不同穩溫點煙葉脫水速度不同，煙葉含水量不同，導致多酚氧化酶活性不同所致。定色期慢升溫定色處理的多酚氧化酶（PPO）活性顯著低于快速升溫定色處理，較不易發生棕色化反應[53]。

4.2 陳化 煙葉陳化可以達到完善煙葉品質和提高煙葉可用性的目的。陳化期間，不同溫濕度條件下，總酚、綠原酸、蕓香苷含量在陳化過程中整體上呈下降趨勢，其中前期（0～12個月）下降幅度較大，中后期（12～21個月）較緩，此后至陳化結束基本穩定[54]。陳化初期煙葉褐變主要由綠原酸氧化所導致，后期引起顏色變化的內因已不是綠原酸的氧化反應[55]。因此，煙葉陳化的前12個月控制綠原酸的氧化程度可防止煙葉陳化初期褐變。陳化條件下，煙葉綠原酸含量隨溫度、濕度、氧氣濃度的增加而減少，褐變程度隨溫度、空氣濕度的增加而增加；烤煙的綠原酸含量與煙葉顏色值呈負相關，溫度和空氣濕度都可以加速綠原酸的氧化，增加煙葉的褐變程度[56]。因此，陳化前期調控貯藏的溫濕度條件，可抑制綠原酸的氧化，防止煙葉的褐變。

5 展望

前人的研究大都集中在煙草綠原酸與煙葉品質以及合成、代謝過程中相關酶類的關系上，對調制中的研究也多集中在棕色化反應上[41]。而21世紀初煙葉的品質風格和安全性開始進入可用性指標系列[57]，仍有許多問題尚有待進一步研究。綠原酸是影響抽吸安全性的重要因素，通過哪些措施來降低其負面影響？綠原酸熱解轉化物兒茶酚對人體健康有害，培育出與形成兒茶酚水平低的煙草品種，是人們迫切需要的。煙株體內綠原酸含量的因素很多，通過改變哪些關鍵措施才能達到適宜的綠原酸含量，而與其他化學成分又比較協調？綠原酸對煙株生長和抗逆的作用生理機制如何？同時，煙葉中綠原酸與煙草香氣成分的關系也有待研究。目前我國卷煙正處于特色煙葉開發的關鍵時期，探索特色煙區最適宜綠原酸積累的關鍵因子與特色煙葉形成的關系等方面的研究，必將成為目前及今后一段時間煙草科研工作的研究重點之一。

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（責編：張宏民）