木薯過氧物酶基因序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯誘導表達特性

叢漢卿 龍婭麗 齊堯堯 朱文麗 陳松筆 喬飛

摘要：【目的】分析木薯Class III過氧化物酶（POD）基因（MePOD）的序列特征，并檢測乙烯（ET）和茉莉酸（JA）逆境信號對其表達的影響，為研究木薯對逆境脅迫的響應和調控模式及培育抗逆新品種提供理論依據?！痉椒ā繌哪臼砘蚪M數據庫中獲取MePOD基因序列并進行分析；以木薯品種華南8號懸浮培養細胞為材料，利用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測木薯MePOD基因在乙烯利和茉莉酸甲酯（MeJA）處理后的表達特性?！窘Y果】MePOD基因編碼區含4個外顯子和3個內含子；轉錄起始位點位于起始密碼子上游1061 bp處；啟動子區域含多個順式作用元件，但無ET和JA響應元件。MePOD蛋白由331個氨基酸組成，分子量為37.476 kD，理論等電點為8.66；有一個含信號肽的跨膜結構，是一種陽離子分泌型Class III POD。系統發育進化樹分析結果表明，木薯MePOD蛋白與大戟科橡膠樹（Hevea brasiliensis，ADR70870.1）的親緣關系最近，且除兩種裸子植物外，其他17種被子植物聚為一類，且同一科植物進一步相聚，此結果與進化地位一致。qPCR檢測結果表明，MeJA誘導0.5 h后，MePOD基因表達量整體上呈先升高后下降的變化趨勢，而乙烯利誘導0.5 h后其表達量呈緩慢上升的變化趨勢，但整體上維持在本底水平之下。【結論】JA和ET逆境信號不直接通過相應響應元件上調MePOD基因表達，而與其他激素信號進行綜合調控，并進一步參與植物體內的抗氧化過程。

關鍵詞： 木薯；過氧化物酶（POD）基因；乙烯（ET）；茉莉酸（JA）；表達分析

中圖分類號： S533 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）12-2009-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to analyze sequence characteristics of Manihot esculenta Crantz Class III peroxidase gene（MePOD） and detect its expression stimulated by two stress signals viz.， ethylene（ET） and jasmonic acid（JA） in cassava， in order to lay theoretical foundation for studying response of M. esculenta Crantz to stress and breeding new resistant varieties. 【Method】MePOD gene sequence was obtained from Cassava Genome Database. Using suspension cultured cells of M. esculenta Crantz variety SC8 as materials， expression characteristics of MePOD gene were investigated by real-time quantitative PCR（qPCR） technique after being induced by ethephon and methyl jasmonate（MeJA）. 【Result】Results showed that， coding region of MePOD gene contained four extrons and three introns， and its transcription initiation site was located at the upstream 1061 bp of start codon. There were many cis-acting elements excluding JA and ET responsive elements in promoter region of MePOD gene. Furthermore， MePOD protein was composed of 331 amino acids and 37.476 kD in molecular weight， theoretical isoelectric point was 8.66， and it contained a transmembrane structure with a signal peptid， so it was secretory cationic Class III POD. Phylogenetic tree analysis showed that， MePOD protein of M. esculenta Crantz had a close genetic relationship with POD of Hevea brasiliensis（ADR70870.1） belonging to Euphorbiaceae. Seventeen species of angiosperms were clustered into one category except two species of gymnospermae， and the same family was clustered together. The above results were consistent with evolutionary status. qPCR results showed that， MePOD gene expression increased firstly and then decreased after being induced by MeJA for 0.5 h， whereas MePOD gene expression increased slowly but maintained below background level after being induced by ethephon for 0.5 h. 【Conclusion】In the absence of JA and ET responsive elements， MePOD gene can not be up-regulated directly， but can be regulated by integrating different hormones signals， and then participate in antioxidation processes.

Key words： Manihot esculenta Crantz； peroxidasen（POD） gene； ethephon（ET）； jasmonic acid（JA）； expression analysis

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）屬于大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot），原產熱帶南美洲（Laban et al.，2013），是第六大糧食作物，也是世界三大薯類作物之一，具有高光效、高淀粉產量、抗干旱、耐貧瘠等特性（張何芳等，2012）。逆境脅迫影響植物的生長發育，但植物會在進化過程中形成相應的抗脅迫機制，并通過生理生化指標的改變來響應各種脅迫（Cheng et al.，2013）。過氧化物酶（POD）是一種重要的植物抗氧化保護酶，與植物的抗逆性密切相關，可作為植物應對逆境脅迫的生物標記之一，其中Class III POD是一種植物特有的分泌型蛋白酶，參與生長素代謝、細胞壁延伸和加厚、活性氧和活性氮代謝及抗病等生理活動（孟艷艷等，2011）。因此，研究POD基因在木薯逆境中的響應模式和抗性調控機制對提高木薯抗逆性和產量具有重要意義。【前人研究進展】Class III POD是一個多基因家族，具有多種同工酶和酶促反應類型，參與植物的多個生命活動（Passardi et al.，2005）。1965年，Hinman和Lang發現Class III POD參與吲哚乙酸（IAA）代謝，具有催化IAA氧化脫羧的能力（Beffa et al.，1990），并證實Class III POD參與植物激素代謝（Hiraga et al.，2001）。當植株受到病原菌侵染時，Class III POD基因表達水平上調（Almagro et al.，2009），表達蛋白形成結構障礙或產生大量活性氧（ROS）和活性氮（RNS），構成一個高毒性區，從而抑制侵染部位的擴大（Passardi et al.，2005），其中高等植物中Class III POD基因表達受真菌（Harrison et al.，1995）、病毒（Hiraga et al.，2000）、細菌（Hilaire et al.，2001）和毒素（Jansen et al.，2004）等誘導，表明Class III POD參與了植物的抗病過程（Ostergaard et al.，2000；Hiraga et al.，2001；Passardi et al.，2004b）。由于Class III POD能催化聚合木質素亞基分子在氧化連接過程中產生的酚類物質，因此Class III POD也參與了木質素合成（Barcelo et al.，2007），但此過程依賴于H2O2的存在（Weir et al.，2005）。此外，Class III POD還參與了細胞壁的延伸和加厚（Bernards et al.，2004）、纖維伸長（Mei et al.，2009）等過程。【本研究切入點】目前，已有學者研究了番茄（Thaler，1999）、枸杞（段文昌等，2012）、棉花（楊世勇等，2013a，2013b）、青楊（越慧芳等，2013）和長白落葉松（王杰等，2015）等作物中逆境信號分子對Class III類POD基因的表達調控作用，但鮮見木薯POD基因響應茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信號的文獻報道?！緮M解決的關鍵問題】對木薯Class III POD基因（MePOD）（Manes.16G007300）進行序列分析及乙烯利與茉莉酸甲酯（MeJA）誘導表達分析，研究ET和JA信號分子對MePOD基因表達的影響及其表達特性，為進一步研究木薯對逆境脅迫的響應和調控模式打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

木薯品種華南8號（SC8）懸浮培養細胞由葉片愈傷組織液體懸浮培養獲得，保存于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所?？俁NA小量制備試劑盒購自美國Axygen公司；PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 MePOD基因結構及啟動子區序列分析 根據JGI木薯基因組數據庫MePOD的CDS序列和DNA序列（Prochnik et al.， 2012），用GSDS分析其內含子相位，用TSSP分析轉錄起始位點，用PlantCARE綜合分析啟動子區序列，尋找順式作用元件位點。

1. 2. 2 MePOD蛋白分析 利用BLAST對MePOD氨基酸序列進行比對分析；利用PortParam預測其蛋白分子量和等電點，利用InterPro預測結構域，利用TMHMM Server進行跨膜區預測，利用SignalP預測信號肽，利用PSIPRED預測二級結構，利用Swiss-model預測三級結構，利用PFP預測蛋白功能。

1. 2. 3 序列比對和進化樹分析 利用MEGA 6.0對18種作物與木薯進行POD氨基酸序列比對，并使用鄰接（Neighbor-joining，N-J）法構建系統發育進化樹。使用Bootstrap方法1000次重復對系統發育進化樹進行驗證。

1. 2. 4 誘導表達 吸取1 mL處于指數增長期的懸浮培養細胞于離心管中，置于25 ℃搖床穩定0.5 h，共3組，其中2組分別用400 μL/L的乙烯利和MeJA處理，另1組未處理為對照，每組設3個重復。取處理后0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 h共5個時間點的樣品，微離心后，棄上清液，于氮液速凍后-80 ℃備用保存。

1. 2. 5 qPCR檢測 按照總RNA小量制備試劑盒說明提取樣品總RNA，利用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。最后，使用SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）實時定量試劑盒檢測MePOD基因在懸浮培養細胞中乙烯利和MeJA誘導表達情況，以18S rRNA為內參。qPCR反應體系10.0 μL： 2×SYBR Premix Ex Taq 5.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，以ddH2O補足至10.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環。所用MePOD基因和18S rRNA引物均用Primer Premier 5.0設計，由Invitrogen公司合成，引物序列如表1所示。

2 結果與分析

2. 1 基因序列分析結果

MePOD基因序列（圖1和表2）分析發現，MePOD基因編碼區含4個外顯子和3個內含子；轉錄起始位點位于起始密碼子上游1061 bp處；啟動子區域包含典型啟動子調控元件CAAT-box和TATA-box、多個光響應順式元件及熱脅迫響應的順式元件、分生組織特異活化的順式作用元件、HvMYB結合位點各1個等，但無ET響應元件和JA響應元件。

2. 2 蛋白結構分析結果

MePOD蛋白由331個氨基酸組成，分子量為37.476 kD，理論等電點為8.66。結構域分析結果表明，MePOD屬于Plant_peroxidase_like亞家族，具有Secretory_peroxidase結構域。同源性比對分析發現，其與陽離子型POD、分泌型POD和Class III POD相似度最高?？缒^預測分析結果顯示，MePOD蛋白可能有一個跨膜結構，且含信號肽結構。二級結構預測結果顯示，MePOD蛋白含有15個螺旋結構和1個折疊結構，可參考其三級結構（圖2）。蛋白功能預測結果顯示，MePOD蛋白最符合Gene Ontology（GO）中的GO：0004601條目，具有POD活性。

2. 3 系統發育進化樹分析結果

從系統發育進化樹（圖3）可看出，木薯MePOD蛋白與木本植物如橡膠樹（Hevea brasiliensis，ADR70870.1）、木欖（Bruguiera gymnorhiza，ADD54644.1）和毛白楊（Populus tomentosa，AKE81099.1）親緣關系較近，其中與同為大戟科的橡膠樹最近，處于同一分支。豆科的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，XP_003610431.1）和鷹嘴豆（Cicer arietinum，NP_001266136.1）處于同一分支，大豆（Glycine max，NP_001237601.1）和菜豆（Phaseolus vulgaris，AHA84196.1）處于同一分支，且四者處于同一大分支上。錦葵科的木棉（Gossypium arboreum，KHG03947.1）和陸地棉（Gossypium hirsutum，AAA99868.1）處于同一分支。山茶科的油茶（Camellia oleifera，ACT21094.1）與?？频拇ㄉ＃∕orus notabilis，XP_010092206.1）親緣關系也較近，木薯MePOD蛋白與馬鞭草科的海欖雌（Avicennia marina，BAB16317.1）、夾竹桃科的長春花（Catharanthus roseus，AAY-26520.1）親緣關系最遠。其他作物如可可（Theobroma cacao，XP_007026071.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_ 567641.1）、文心蘭（Oncidium hybrid cultivar，ABC- 02343.1）均單獨分支。裸子植物云杉（Picea abies，CAD92856.1）和黑松（Pinus thunbergii，AHN05533.1）位于進化樹基部，是較被子植物更原始的類群。綜上所述，除兩種裸子植物外，其他17種被子植物聚為一類，且同一科植物進一步相聚，此結果與進化地位一致。

2. 4 基因表達水平檢測結果

為排除MePOD基因本底變化造成的影響，將MeJA和乙烯利誘導后的MePOD基因表達量值除以對照的表達量。擬合曲線顯示MePOD基因表達在乙烯利和MeJA誘導后呈不同的響應趨勢（圖4），MeJA誘導0.5 h后整體上呈先升高后下降的變化趨勢，乙烯利誘導0.5 h后其表達呈緩慢上升的變化趨勢，但整體上維持在本底水平之下。

3 討論

細胞是植物基本的結構和功能單位，具有所有遺傳信息。懸浮培養細胞具有對外界信號響應一致的特點，尤其適用于相對表達量不高、易被背景淹沒的基因表達分析研究。本研究中，MePOD基因在0.5 h內對逆境信號分子作出響應進行誘導表達，且重復間誤差均較小，表明供試材料適用于其基因表達分析。

Class III POD與Class I POD是胞內抗壞血酸過氧化物酶（APX）共同的原核起源，但Class III POD是分泌到細胞壁或周圍介質中。Class I POD仍保存著細菌的基因序列信息，Class III POD則在進化中發生了基因變異，僅保存了蛋白結構上的相似性（Schuller et al.，1996）。所有陸生植物為適應高氧的陸生生活均進化產生Class III POD（Passardi et al.， 2004a）。這個多基因家族的進化與植物組織結構的復雜性、生存環境及病原物的多樣性密切相關。本研究通過對木薯MePOD蛋白生物信息學分析，發現其屬于Plant_ peroxidase_like亞家族，具有Secretory_peroxidase結構域，是一種分泌型POD；其理論等電點為8.66，是一種堿性陽離子型POD。通過同源比對也發現其與陽離子型POD、分泌型POD和Class III POD的相似度最高。由此推測，MePOD是一種屬于Class III的陽離子分泌型POD。

JA和ET是植物逆境響應的信號分子。其中，JA具有誘導植物防御基因表達、調控植物對機械傷害、鹽害及紫外線照射等非生物脅迫反應的功能（Wasternack and Hause， 2013）。ET可引起植物多種生理效應和形態建成，如對環境脅迫反應、偏上生長、器官衰老與脫落、種子萌發、果實成熟等。此外，多種調控果實后熟、植物衰老的酶及由傷害或脅迫誘導的防御蛋白基因序列均含ET響應元件（Johnson and Ecker，1998；Bleecker and Kende，2000）。本研究的qPCR檢測結果顯示，經乙烯利和MeJA處理后，MePOD基因表達呈不同的響應趨勢，MeJA處理后0.5～4.0 h MePOD基因表達上調，之后又逐漸回落，而經乙烯利處理后，MePOD基因表達整體上維持在本底水平之下。由啟動子區元件分析結果顯示，MePOD基因既無JA響應元件，又無ET響應元件，表明其不受ET和JA信號的直接調控，而是間接調控。由此推測，JA信號激活了其他信號途徑，從而引起MePOD基因表達上調。

大量研究證實，JA信號能引起POD基因表達上調，如外源JA或MeJA可刺激番茄（Thaler，1999）、枸杞（段文昌等，2012）、青楊（越慧芳等，2013）、棉花（楊世勇等，2013a，2013b）和長白落葉松（王杰等，2015）的POD酶活性明顯增加，以增強植物抗性，與本研究結論一致。本研究還發現，ET信號的作用卻相反，說明存在其他機制造成其下調并維持在低表達水平。已有研究證明，ET對抗氧化酶的調控是以H2O2為中介（孟艷艷等，2014），但ET和H2O2在抗氧化反應中的信號傳導機理還需進一步研究。植物中JA和ET與其他信號轉導通路間激素的交叉互作在整個生育周期內的不同組織器官間、不同類型細胞中一直存在（Johnson and Ecker，1998；Bleecker and Kende，2000；Wasternack and Hause， 2013），表明不同激素信號的整合共同調控了植物的生長發育、對環境的響應及衰老死亡。本研究發現，MePOD基因的啟動子區還有其他多種響應元件，推測ET和JA與其他不同激素的交叉互作產生了不同的調控模式，最終造成MePOD基因表達量的差異。雖然本研究已明確木薯的MePOD基因可受到JA和ET信號影響，并初步確定其表達特性，但其還能影響哪些生物學過程及如何影響，仍需進一步探究。

4 結論

JA和ET逆境信號不直接通過相應響應元件上調MePOD基因表達，而與其他激素信號進行綜合調控，并進一步參與植物體內的抗氧化過程。

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（責任編輯 陳 燕）