蠶沙纖維素降解菌HB—2菌株的分離、鑒定及酶活性分析

岑貞陸 胡鈞銘 韋仕巖 何鐵光 李婷婷 曾泉

摘要：【目的】篩選蠶沙纖維素降解菌株，為蠶沙無害化快速腐熟處理提供優質菌種?！痉椒ā恳孕Q沙為材料，利用 CMC-Na培養基分離蠶沙纖維素降解菌，通過形態學、生化特征和16S rDNA序列測定方法等對分離獲得的纖維素降解菌進行分類學鑒定，并研究碳源、氮源、pH、培養時間和培養溫度對分離菌株產酶活力的影響?！窘Y果】從蠶沙中篩選出1株高溫型細菌，命名為HB-2菌株。根據菌體大小、鞭毛著生位置及數量、16S rDNA核酸序列分析，并結合生理生化特性，HB-2菌株鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。HB-2菌株最佳產酶條件為復合碳源（蠶沙+微晶纖維素+米糠+麩皮）、復合氮源（蛋白胨+酵母膏），產纖維素酶最適反應 pH 6.5，最適溫度35 ℃?！窘Y論】HB-2菌株CMCase活性較敏感且產酶量大，具有制成菌劑應用于蠶沙無害化快速腐熟的潛力。

關鍵詞： 蠶沙；纖維素降解菌；短小芽孢桿菌；鑒定；酶活性

中圖分類號： Q939.124 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）12-2065-07

Abstract：【Objective】Cellulose-degrading bacteria were isolated from silkworm， in order to provide high-quality strain for harmless quick composting of silkworm excrement. 【Method】Using CMC-Na culture medium， cellulose-degrading bacteria were isolated from silkworm excrement. Then obtained cellulose-degrading bacteria were identified based on its morphology， biochemical characters， 16S rDNA sequence etc. And effects of carbon source， nitrogen source， pH， culture time and culture temperature on cellulase activity of isolated strain were studied. 【Result】Results showed that， a strain of high-temperature resistant bacterium was screened out， which was named HB-2 strain. According to its size， flagella position and number， 16S rDNA sequence and physio-biochemical characteristics， HB-2 strain was identified as Bacillus pumilus. Enzyme-producing conditions of HB-2 strain were as follows： composite carbon sources including silkworm excrement+microcrystalline cellulose+rice bran+wheat bran， composite nitrogen sources including peptone+yeast extract， optimum pH for cellulose producing being 6.5， optimum temperature for cellulose producing being 35 ℃. 【Conclusion】HB-2 strain has sensitive CMCase activity and produces a large amount of cellulase， so which can be made into bactericide， then applied to harmless quick composting of silkworm excrement.

Key words： silkworm excrement； cellulose-degrading bacteria； Bacillus pumilus； identification； enzyme activity

0 引言

【研究意義】蠶沙是蠶排出的糞便、食剩殘桑及蠶座墊料的統稱（楊海霞等，2002）。近年來，隨著我國“東桑西移”工程的推進發展，養蠶集約化程度逐步提高，蠶沙產生量也逐年增加。目前蠶沙的利用率較低，除極少部分被用來提取葉綠素、蛋白質和果膠等外，部分蠶沙堆漚用作肥料（高云超等，2011），但蠶沙富含蛋白質和大量難降解的纖維素，由于纖維素降解速度較慢，致使蠶沙堆肥發酵時間長、肥效低，同時，發酵過程中產生的臭味難以消除而造成空氣污染，雨水沖刷又極易造成面源污染（劉鵬等，2014）；此外，未經處理直接丟棄的蠶沙帶有的蠶病原菌傳播和環境污染問題等嚴重影響桑蠶產業的可持續發展。因此，篩選和分離高產纖維素酶的功能降解菌種，研究其對蠶沙纖維素的降解能力，對蠶沙的生物無害化處理，實現蠶沙資源化循環利用具有重要意義。【前人研究進展】目前，木質纖維素降解酶的研究與應用主要集中于產酶量大、酶系組成較齊全的菌株（孫憲昀等，2007）。張明珠等（2008）從江蘇省泰州市的農田土壤和木材廠腐爛的木材中篩選出白腐真菌、綠色木霉、纖維單胞菌、肋生菌、單胞菌、黑曲菌和節桿菌等7種具有降解纖維材料能力的菌株。王洪媛和范丙全（2010）采用濾紙片孔洞法、濾紙條降解法、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水解圈測定法、秸稈失重法、纖維素分解率測定法、胞外酶活測定法等常規秸稈纖維素降解菌的篩選方法，篩選獲得3株高效秸稈纖維素降解真菌菌株。已有學者利用纖維素降解菌對動物草料青貯、動物飼料、甘蔗渣等的纖維素降解效果進行評價。王賢豐等（2015）從海水中篩選得到2株對甘蔗渣纖維素酶活力較高的纖維素降解菌Z4和S5，兩者適宜比例的混合發酵可明顯提高對甘蔗渣纖維素的降解能力。黃勤樓等（2016）從引進的多種纖維素降解菌中篩選出酶活力較高的11、21和36號菌株，3株菌株均能改善牧草的青貯品質，且不同程度地降解牧草纖維素。王堯悅等（2016）對課題組前期分離保存的一株纖維素降解菌進行鑒定，并檢測其對飼料粗纖維的降解效果，結果表明，分離到的纖維降解菌為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis N3，N3菌株主要分泌分子質量70 ku以上、耐熱的纖維素酶，對飼料粗纖維有較強的降解能力?！颈狙芯壳腥朦c】目前鮮見蠶沙堆肥中纖維素降解菌的文獻報道，僅岑貞陸等（2013a）通過不同的培養基查明廣西蠶沙纖維素降解菌群中細菌、放線菌、真菌的分離頻率，以及對放射線菌T-1菌株的產酶條件進行了研究，但尚未對分離所得菌株進行鑒定，菌株分類學地位不明確，致使其利用缺乏依據?！緮M解決的關鍵問題】采用濃度梯度稀釋法從蠶沙堆肥中分離纖維素降解菌，對分離獲得的纖維素降解菌開展分類學鑒定，并測定菌株纖維素酶活性，以期為蠶沙無害化快速腐熟處理提供優質菌種。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料蠶沙采自廣西南寧市橫縣云表鎮。

供試培養基：NA培養基（方中達，1998）：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，蔗糖5.0 g，瓊脂 17.0 g，蒸餾水1 L， pH 7.0；CMC-Na培養基（王海濱等，2015）：CMC-Na 10.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂17.0 g/L，pH 7.0。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 纖維素降解菌的分離及酶活性測定 纖維素降解菌分離參照張楠等（2010）的方法進行。若觀察到菌落生長處及周圍形成一透明圈，則表明獲得目標纖維素降解菌，將目標纖維素降解菌菌株純化后備用。

對分離所得菌株進行纖維素酶活性測定，其中羧甲基纖維素酶（CMCase）和濾紙酶（FPAase）活性測定參照張楠等（2010）的方法執行。

1. 2. 2 分離菌株形態學觀察 分離所得菌株在NA培養基上培養24～36 h后參照文獻（方中達，1998）進行革蘭氏染色觀察，并觀察菌落及菌體形態。

1. 2. 3 分離菌株生理生化測定 分離所得菌株采用微量反應管（購自杭州天和微生物試劑有限公司）進行生理生化測定，測試項目有葡萄糖氧化發酵測定、硝酸鹽還原反應、反硝化、甲基紅（M.R.）、H2S、牛奶分解、明膠液化、接觸酶反應、氧化酶反應、Tween-80、檸檬酸鹽的利用、吲哚試驗等12項指標，結果參照《伯杰細菌鑒定手冊》（Buchanan and Gibbons，1984）和《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）進行分析。

1. 2. 4 16S rDNA基因序列測定及系統發育進化樹構建

1. 2. 4. 1 DNA提取 采用煮沸法（岑貞陸等，2013b）提取測試菌株的基因組DNA：挑取一環新鮮菌苔（NA培養基上30 ℃培養24 h）于0.5 mL無菌水中振蕩混勻；于100 ℃沸水中煮5 min，迅速置于冰水混合物中冰浴10 min后120 r/min 離心8 min，取上清液作為模板DNA，-20 ℃保存，用于PCR擴增。

1. 2. 4. 2 菌株DNA的PCR擴增 PCR擴增采用16S rDNA細菌通用引物，正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3'，反向引物：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。PCR反應體系25.0 μL，包括10× Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.0 μL， E×Taq enzyme（5 U/μL）0.2 μL，正向引物（10 pmoL）1.0 μL，反向引物（10 pmoL）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 18.3 μL，以ddH2O為模板作陰性對照。擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統儀進行觀察及拍照，并送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1. 2. 4. 3 系統發育進化樹構建 核苷酸序列利用Clustal X 1.81進行聯配，聯配結果用BIOEDIT編輯，利用MEGA 4.0構建由核苷酸序列生成的系統發育進化樹，參數利用Neighbour-Joining，通過1000次Bootstrap抽樣及最大似然組成模型。

1. 2. 5 分離菌株產酶條件

1. 2. 5. 1 不同碳源對分離菌株產酶的影響 去除碳源后的發酵培養基分別加入5%碳源（蠶沙、米糠、微晶纖維素、蠶沙+米糠、麩皮、微晶纖維素+米糠、蠶沙+麩皮、米糠+麩皮、微晶纖維素+麩皮、蠶沙+微晶纖維素+米糠+麩皮），接種分離菌株培養，分別測定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 2 不同氮源對分離菌株產酶的影響 去除氮源后的發酵培養基分別加入4%氮源[KNO3、（NH4）2SO4、NH4CL、尿素、蛋白胨、酵母膏、尿素+酵母膏、尿素+蛋白胨、酵母膏+蛋白胨]，接種分離菌株后培養，分別測定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 3 不同pH對分離菌株產酶的影響 分別將發酵培養基的pH調為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，接種分離菌株培養7 d后，分別測定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 4 不同溫度對分離菌株產酶的影響 發酵培養基接種分離菌株后分別置于不同溫度（30、35、40、45、50和55 ℃）下培養，然后分別測定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 5 不同培養時間對分離菌株產酶的影響 發酵培養基接種分離菌株后連續培養10 d，每天測定CMCase和FPAas活性。

2 結果與分析

2. 1 目標纖維素降解菌的分離及其酶活測定結果

從樣品中篩選出1株高溫型細菌，命名為HB-2菌株。HB-2菌株菌落直徑3.18 mm，水解圈半徑8.26 mm（圖1），水解圈半徑與菌落直徑的比值為2.60， CMCase和FPAase活性分別為3.32和0.70 U。

2. 2 HB-2菌株形態學觀察結果

HB-2菌株單菌落呈不規則狀，表面褶皺凸起，邊緣多枝，菌落黃色，不透明，無粘性，無可溶性色素產生，無運動性，革蘭氏染色陽性，有芽孢（圖2）。在透射電鏡下觀察，菌體呈桿狀，兩端圓鈍，菌體大小約1.0 μm×2.4 μm，顏色較深，鞭毛周生（圖3）。

2. 3 HB-2菌株生理生化測定結果

測定結果（表1）顯示，HB-2菌株生理生化反應為陽性的項目有：氧化酶、接觸酶、檸檬酸鹽利用、H2S、明膠液化、牛奶分解和Tween-80；生理生化反應為陰性的項目有：葡萄糖氧化發酵、M.R.、硝酸鹽還原、吲哚試驗和反硝化。

2. 4 HB-2菌株系統發育進化樹構建及同源性分析

經過引物對HB-2菌種進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1條約1500 bp條帶（圖4），經測序后得到的16S rDNA序列提交至www.ncbi.nlm.nlh.gov，BLAST比對結果表明，HB-2菌株與IHBB9209、NE16、MB-P8等Bacillus pumilus菌株的序列相似性在99.%以上。采用MEGA 4.0分析，結果發現HB-2菌株與登錄號為KR085783.1、KR868768.1、KP235238.1、HM022734.1等B. pumilus聚成一簇（圖5），與同屬的其他種存在明顯的遺傳距離。結合形態學特征及生理生化性狀，可將HB-2菌株鑒定為短小芽孢桿菌（B. pumilus）。

2. 5 HB-2菌株產酶條件

2. 5. 1 碳源對HB-2菌株產酶的影響 由表2可看出，碳源對HB-2菌株產酶能力有不同程度的影響。HB-2菌株對復合碳源的利用明顯強于單一碳源，可溶性碳源和不溶性碳源組成的復合碳源能更有效地誘導該菌產生纖維素酶，其中以蠶沙+微晶纖維素+米糠+麩皮為碳源時CMCase和FPAase的活性最高，分別為17.8和3.4 U。

2. 5. 2 氮源對HB-2菌株產酶的影響 表3結果顯示，KNO3、NH4CL、（NH4）2SO4和尿素等無機氮源對誘導HB-2菌株產CMCase和FPAase能力均較弱。蛋白胨、酵母膏、蛋白胨+酵母膏等有機氮源有利于誘導HB-2菌株產CMCase，其中以蛋白胨+酵母膏為復合有機氮源的處理區產CMCase最高（16.4 U）；HB-2菌株對供試氮源產FPAase不敏感，所有處理區的酶活性不超過3.7 U（表3）。

2. 5. 3 pH對HB-2菌株產酶的影響 由圖6可知，HB-2菌株在pH 4.0～10.0均可產酶，隨著pH升高，FPAase活性隨之增加，但增幅很窄，在供試pH內FPAase活性不超過2.0 U；而CMCase活性對pH較敏感，當pH為5.5時酶活開始陡升，當pH為6.5時CMCase活性達到峰值（8.0 U），此后下降。

2. 5. 4 溫度對HB-2菌株產酶的影響 由圖7可知，HB-2菌株在30～55 ℃時均可產酶，但CMCase活性比FPAase活性變幅大，FPAase活性變幅較平緩，表明CMCase比FPAase對溫度更敏感。當溫度為35 ℃時CMCase活性達峰值（7.0 U），此后酶活隨溫度升高而降低，酶活性曲線變陡降值明顯；當溫度為50 ℃以后，CMCase活性趨于平穩，不超過4.0 U。FPAase對溫度不敏感，酶活性變幅平緩，供試溫度內不超過2.0 U。

2. 5. 5 培養時間對HB-2菌株產酶的影響 由圖8可知，接種HB-2菌株第2 d后 FPAase活性略有降低，第4 d后開始略微升高，但增值非常緩慢，直至第8 d才達到最高值（2.0 U）；接種后第1～6 d CMCase活性緩慢增加，第6 d后增值明顯，第8 d達最高值（7.0 U）。

3 討論

本研究根據菌體大小、鞭毛著生位置及數量、16S rDNA核酸序列分析，并結合生理生化指標對HB-2菌株進行鑒定，發現HB-2 菌株屬短小芽孢桿菌（B. pumilus）。B. pumilus是芽孢桿菌屬的一種，在自然界普遍存在，在水樣、土樣、禽畜糞便、動物、植物（張立靜等，2011；霍培元等，2012；韋露等，2015）等各種環境中均可分離獲得。該菌有的可產生抗菌素及抗菌蛋白等拮抗物質，抑菌范圍廣，對動植物多種病原菌具有抑制作用（王靜等，2010），有的可作為微生物飼料添加劑（徐鵬等，2012），有的能產生抗腫瘤多糖（梁靜娟等，2006），有的可降解苯并[a]芘（朱婷婷和倪晉仁，2012）。本研究明確了HB-2菌株能降解蠶沙纖維素，有利于豐富人們對B. pumilus生物學多樣性的認識。

石美寧等（2012）利用酵素菌、劉鵬等（2014）通過草酸青霉菌、賓榮佩等（2015）采用多種復合菌劑應用于蠶沙堆肥促進腐熟研究，但上述研究者均以外源菌劑微生物途徑對蠶沙進行堆肥促腐，而本研究探討內源菌株（蠶沙土著微生物纖維素降解菌B. pumilus）的酶活性及其降解特性，這方面的研究國內鮮有報道。 無論是外源菌劑還是內源菌株，目前蠶沙的微生物降解可供選擇的菌種譜仍明顯狹窄。蠶沙中微生物體系相當復雜，目前尚未發現蠶沙菌群結構及其時空分布的文獻，除從樣本分離獲得HB-2菌株外，還有其他細菌和放射線菌（岑貞陸等，2013a），由于可供參考的資料和基因庫信息極為有限，更多的蠶沙土著微生物的鑒定工作尚待開展，對于HB-2菌株在蠶沙堆肥降解纖維素的機制及其遺傳調控基礎等問題也有待進一步深入研究。

4 結論

功能性纖維素降解菌HB-2菌株有芽孢且適宜生長的溫度及pH均較廣，具有較高的抗逆性和適應力，方便儲存和運輸；HB-2菌株CMCase酶活較敏感且產酶量大，具有制成菌劑應用于蠶沙無害化快速腐熟的應用潛力。

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（責任編輯 麻小燕）