辣椒CaDREB3基因的克隆和表達特性分析

馮冬林　何水林　賴燕

摘 要 從構建的辣椒cDNA文庫中篩選陽性克隆，測序并獲得辣椒CaDREB3基因，研究該基因的亞細胞定位、瞬時表達及組織表達特性，揭示CaDREB3的功能及其在植物抗逆過程中的分子機制。應用預測軟件對其進行功能及生物信息學分析，利用qRT-PCR分析CaDREB3基因的瞬時表達及在不同組織中的表達特性，并以基因槍轟擊洋蔥表皮的方法，對CaDREB3基因進行亞細胞定位分析。結果表明，辣椒CaDREB3長度為1 997 bp，含有1071bp的完整的開放閱讀框，編碼357個氨基酸，含有ERF亞族的AP2/ERF保守結構域，與西紅柿（NP_001234707.1）、馬鈴薯（AET99101.1）及擬南芥（NP_177931.1）具有較高的氨基酸相似性，其中與西紅柿的相似性最高，達83%。亞細胞定位表明該基因位于細胞核，瞬時表達表明CaDREB3可以和GCC-box結合，qRT-PCR檢測表明， CaDREB3基因的相對表達量在辣椒莖、葉和果實中表達量較高。實驗明確了辣椒CaDREB3基因亞細胞定位信息和組織表達情況，為進一步研究其功能及分子機制提供依據。

關鍵詞 辣椒；CaDREB3；亞細胞定位；瞬時表達；熒光定量RT-PCR

中圖分類號 Q781 文獻標識碼 A

在植物中廣泛存在ERFs轉錄因子家族成員，ERFs家族成員包含有1個AP2/ERF保守結構域，該結構域包含約60～70個氨基，根據該結構域第14位和19位氨基酸殘基的不同，可以將ERFs家族分為ERF亞家族和DREB亞家族。DREB亞家族成員的AP2/ERF保守結構域在第14位和19位分別為纈氨酸和谷氨酸，區別于ERF的丙氨酸和天冬氨酸。同時DREB轉錄因子序列中含有一段Ser/Thr區域，研究表明該序列在基因互作中起到重要作用[1]。

Sakuma[2]根據轉錄因子因結構及功能上的不同，將DREBs亞族轉錄因子分為A1～A6六個亞組。迄今為止在植物中發現并深入研究的主要是DREB1（A1）和DREB2（A2）兩大類[3]。該兩類轉錄因子都能夠識別DRE（含有A/GCCGAC）順式作用元件，在植物抵抗非生物脅迫如低溫、干旱和高鹽過程中具有重要的作用[4]。Hong等[5]在辣椒中克隆的CaDREBLP1能夠在干旱及鹽脅迫下誘導表達；Chen等[6]研究表明，轉基因GmDREB2大豆能夠增強作物抗旱及抗鹽能力；Liu等[7]研究發現轉基因PpDREB1煙草能夠增強抗鹽、抗旱及抗低溫的能力。Wang等[8]的研究結果表明檸條CkDREB基因不僅在干旱、高鹽及低溫下誘導表達，同時能夠在ABA處理下誘導表達。而DREB2類轉錄因子在生物功能上表現出了比DREB1類轉錄因子更多樣化，在擬南芥中發現的DREB2A、DEB2B基因不僅在干旱、高鹽及低溫下誘導表達，同時能夠在熱激脅迫下誘導表達[9-11]。

除了DREB1和DREB2類轉錄因子，研究表明其他DREB亞組基因在應答逆境脅迫和提高植物抗性上起到一定的作用。A3亞組ABI4基因在ABA和糖信號途徑中具有特殊的作用[12-13]；A4亞組基因同DEEB1類基因相關，過量表達TINY和HARDY[14-15]導致植株生長矮化且葉片濃密；A5亞組基因含有一個保守的EAR（ERF-associated amphiphilic repression）基序[16-17]，轉基因DREB1A或DREB2A CA誘導其上調表達[18-19]；A6亞組RAP2.4和RAP2.4B基因能夠在干旱、高溫及高鹽下誘導表達，RAP2.4和RAP2.4B還分別應答低溫和熱激脅迫[20-21]。

辣椒（Capsicum annuum L.）作為一種世界上重要的蔬菜種類和工業加工原料，在其整個生育時期隨時都會受到外界環境脅迫?，F階段生態環境破壞，常規防治手段效果不明顯反而有時會進一步造成環境惡化，進入惡性循環。在此背景條件下，了解作物抗逆機制，以生物技術及基因工程技術入手，結合常規育種手段，以期選育獲得抗逆性強的品種及控制品種優良性狀的目的。本研究從辣椒cDNA文庫中篩選獲得了一個全長cDNA序列，對其進行了生物信息學分析，暫時命名為CaDREB3。采用基因槍法明確CaDREB3的亞細胞定位信息，及其與順式作用元件瞬間表達分析，利用實時熒光PCR技術檢測了該基因在辣椒不同組織中的表達水平，為進一步深入研究CaDREB3基因的功能提供參考，為研究辣椒DREB轉錄因子介導的抗逆機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

采用福建本地辣椒品種8#材料，構建辣椒葉片cDNA文庫，挑選陽性克隆測序。

1.2 方法

基因克隆與序列分析：隨機挑取cDNA文庫陽性克隆，以M13R為測序引物，測序。利用NCBI和DNAMAN軟件，分析基因序列和其開放閱讀框，進行Blastn序列比對。利用Prosite 數據庫、SMART和WOLF PSORT分別查找功能結構域位點、分析蛋白結構與功能并預測亞細胞定位；利用ClustalX分析分子進化，利用Mega4.1構建系統發育樹。

載體構建：采用Gateway技術。以pDONR207作為入門載體，構建亞細胞定位目的載體pMDC83、瞬間表達分析報告載體pBT10-GUS-GCC和pBT10-GUS-CRT/DRE。載體構建引物如表1。

采用基因槍轟擊洋蔥表皮法進行瞬間表達分析[22]；在熒光顯微鏡下觀察亞細胞定位并采集圖像；利用RT-PCR分析辣椒根、莖、葉、花及果實等組織特異性表達[23]，以actin基因作為內參基因（表2）。

2 結果與分析

2.1 辣椒CaDREB3基因全長cDNA的分離

陽性克隆測序后將EST片段進行分子比對表明：基因全長為1 997 bp，分子量39.214 ku，含有1 071 bp的完整的開放閱讀框，編碼357個氨基酸（圖1）；Blastp顯示該基因與西紅柿SlDREB3（NP_001234707.1）氨基酸序列相似度最高為83%，與馬鈴薯StDREB4（AET99101.1）及擬南芥RAP2.4（NP_177931.1）氨基酸序列相似度均達到47%以上，因此，初步將該基因命名為CaDREB3（圖1）。

2.2 辣椒CaDREB3基因保守結構域及系統進化分析

蛋白結構域分析表明，在AP2/ERF結構域第14位和19位為區別于ERF亞族特有的纈氨酸和亮氨酸，并含有一段保守的WLG序列。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，為ERF家族Ⅰb亞族特有，同時在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2（圖2）。利用MEGA4.0將辣椒CaDREB3與西紅柿及馬鈴薯等37個氨基酸相似序列進行比對，構建系統進化樹（圖3）。結果表明，辣椒CaDREB3與西紅柿及馬鈴薯相關DREB基因同源性最高，在76%以上，同屬于ERF家族Ⅰb（A6）亞族。

2.3 CaDREB3基因組織特異性表達分析

組織表達模式分析結果顯示，在辣椒莖、葉片和果實中CaDREB3均有表達，在根和花中沒有表達。在莖中的表達量最高，而葉片中的表達量次之（圖4）。

2.4 CaDREB3與GCC-box、CRT/DRE順式元件結合能力分析

基因槍轟擊洋蔥表皮細胞，以空載體為陰性對照，分析基因瞬時表達，結果表明該基因能夠與GCC-box盒發生互作，與DRE順式元件不能互作（圖5）。

2.5 CaDREB3亞細胞定位分析

首先利用WOLF PSORT預測CaDREB3的亞細胞定位信息，結果表明，CaDREB3有可能位于細胞核上。CaDREB3-GFP融合蛋白和空載體通過基因槍轟擊洋蔥表皮，在熒光顯微鏡下觀察CaDREB3融合蛋白的亞細胞定位情況。結果發現，空載體分布于整個細胞中，而CaDREB3融合蛋白位于細胞核上（圖6）。

3 討論

DREB和ERF是AP2/EREBP轉錄因子家族中重要的兩個亞族，在抵抗環境和生物、非生物脅迫方面都具有重要的作用。已有研究表明，DREB在抵抗低溫、高鹽及干旱等非生物脅迫方面具有重要的作用[4]，并且能夠應答ABA激素信號。

本研究從辣椒cDNA文庫中挑選陽性克隆，測序并獲得了辣椒CaDREB3基因編碼區序列。分析CaDREB3基因保守結構域發現，在第14位和第19位是DREB亞族特有的纈氨酸和亮氨酸。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，為ERF家族Ⅰb（A6）亞組特有，研究發現該亞族基因玉米DBF1能夠激活干旱應答因子2（DRE2），提高植物抗旱能力[24]。同時在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2，過量表達蒺藜苜蓿MtWXP1可以提高蠟的含量，而WXP1蛋白含有Ⅰb亞族中所有的保守序列[25]。根據Ⅰb（A6）亞組多種植物在抗非生物脅迫上表現，推測CaDREB3可能存在相類似的功能。

大量研究表明DREB轉錄因子能夠特異結合DRE順式元件，從而激活目的基因的表達。而且不同的DREB蛋白可以結合不同的DRE核心序列（ACCGAC和GCCGAC），表明DREB轉錄因子作用機制的復雜性。而本實驗瞬時表達結果顯示CaDREB3可以和GCC-box順式元件相結合，而不能與DRE元件結合，表明CaDREB3可能應答生物脅迫，以調節病程相關（PR）基因的表達。CaDREB3不能夠與CRT/DRE順式元件相結合，或許CaDREB3不能夠應答非生物脅迫，或在生物及非生物脅迫間具有某種交叉信號途經。DREB家族Ⅰb（A6）亞族基因數量不多且功能研究較少，CaDREB3作為其中一員，其功能研究的進一步開展對于該亞族基因在植物中的相關作用具有重要意義。同時序列分析表明CaDREB3不含有EAR元件，暗示了該基因在植物脅迫應答反應中的某種激活機制。

通過WOLF PSORT預測結果表明CaDREB3 可能定位于細胞核上，而亞細胞定位試驗結果表明，CaDREB3定位于細胞核上。因此可以初步判定CaDREB3定位于細胞核上。

綜上所述，CaDREB3作為Ⅰb（A6）亞族一員，由于迄今為止對該亞族基因的功能還不太清楚，同時CaDREB3表現出能夠特異結合GCC-box盒，而不是DRE序列，說明該基因功能及其作用機制都具有一定的不確定性，需要進一步的試驗對其考證并探索DREB的作用原理。

4 結論

本研究成功克隆了辣椒CaDREB3基因，全長1 997 bp，其含有1 071 bp的完整的開放閱讀框，編碼357個氨基酸，在AP2/ERF結構域第14位和19位為DREB亞族特有的纈氨酸和亮氨酸，并含有一段保守的WLG序列。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，為ERF家族Ⅰb亞族特有，同時在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2序列。實時熒光定量PCR檢測結果表明，CaDREB3基因在莖中表達量大幅升高，在葉和果實的表達量也有上升。CaDREB3蛋白主要定位于細胞核中，能夠與GCC-box盒相結合，不能同DRE元件結合。本研究結果為進一步研究CaDREB3蛋白的生物學功能提供了基礎數據，為研究DREB類轉錄因子的功能提供了新的候選基因。

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