甜高粱（遼甜系列）再生體系建立與比較

劉玲利 李叢 樊金娟 朱延姝 崔震海 阮燕曄 宋波 郭志有

摘 要 建立了遼寧省能源專用甜高粱再生體系，篩選適合組織培養的遼甜系列品種，為遺傳轉化奠定基礎。以遼甜系列甜高粱芽基部為外植體，在添加不同激素濃度的MS培養基上誘導愈傷組織，進而獲得再生植株。遼甜4號和遼甜7號在添加500 mg/L水解酪蛋白和3 mg/L 2，4-D的MS培養基上能夠誘導出生長狀態良好的愈傷組織，愈傷組織誘導率達到92%和89%，遼甜4號愈傷組織分化能力比較強，在含有1 mg/L IAA和0.5 mg/L 6-BA的MS培養基上分化率為76%；遼甜1號和遼甜5號出愈率相對較低，愈傷組織狀態差，再生能力較弱。結果表明，能源用甜高粱遼甜系列品種中，遼甜4號更適用于組織培養和遺傳轉化。

關鍵詞 甜高粱；愈傷組織；成熟種子；芽基部；再生體系

中圖分類號：S566.5 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.32.060

甜高粱[Sorghum bicolor（L）.Moench]是C4作物中光合作用效率較高作物之一，生長迅速、糖分積累快、生物學產量高，具有抗旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿和乙醇轉化率高等優點，被認為是最具開發潛力的能源作物之一[1]。然而甜高粱種質資源的匱乏，尤其抗倒伏、含糖量高的品種資源缺乏，傳統的常規育種己不能滿足人們對高能作物甜高粱的需求，分子育種能方便快捷的將所需的優良基因轉入作物，進而獲得性狀優良的作物品種[2]。建立方便、穩定、高效的再生體系和遺傳轉化體系，是分子育種的基礎。甜高粱是公認的再生體系較難的一種作物，大量研究結果表明，高粱愈傷組織的誘導和再生，受到諸多因素的影響。不同品種的選擇、外植體的選擇、培養基成分、外源激素的配比等都是影響高粱組織培養成功的關鍵因素。以往的研究中，甜高粱的組培多以幼胚、幼穗為外植體，但獲取幼胚和幼穗費時、費力，同時受季節、地域的限制，難以保證穩定充足的外植體供應。而來源于成熟種子的外植體，如成熟種子、成熟胚、芽頂端分生組織等可以保證外植體的穩定供給。遼寧省農業科學院高粱研究所育成的能源專用甜高粱遼甜系列品種，具有優質、高產、多抗、廣適等特點。本研究以能源專用甜高粱（遼甜系列品種）成熟種子為材料，選取成熟種子萌發后嫩芽組織的膨大部分為外植體，通過調整培養基激素濃度，篩選出最佳誘導、分化培養基，減輕褐化及水漬化問題；比較不同遼甜品種愈傷組織的誘導，分化及再生能力，篩選適宜組織培養的品種，為后續基因工程研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用的試驗材料為遼甜系列品種：遼甜1號、4號、6號和遼甜7號，由遼寧省農業科學院高粱研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 芽基部膨大組織的分離

將甜高粱種子用75%的乙醇滅菌1 min，然后用0.1%的升汞滅菌15 min，最后用無菌水洗滌6～7次，用無菌濾紙將種子表面水分吸干。將滅菌后的種子胚面朝下，接種于MS+500 mg/L酸水解酪蛋白+2，4-D（2.0、3.0和4.0 mg/L）的誘導培養基中，（25±2）℃黑暗條件下培養3～7 d。選擇芽基部膨大的正常種子，無菌條件下切取帶有種子的膨大部分轉移到繼代培養基中繼續培養，并統計不同品種萌發種子膨大率。

1.2.2 繼代培養

培養5～7 d后，根據膨大部分愈傷組織形成情況，將生長良好的愈傷組織轉移到MS+500 mg/L酸水解酪蛋白+3.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT的繼代培養基上，（25±2）℃黑暗條件下培養28 d。

1.2.3 植株再生

將生長良好的愈傷組織接種于分化培養基（MS+1 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA）上培養30 d，再將芽轉入生根培養基（MS+3 mg/L IBA）上，培養條件為（25±2）℃，每天16 h光照，光照強度為35 μmol/（m2·s）。

1.3 試驗數據的統計分析

初始分生組織膨大率=（接種一周后膨大的分生組織塊數目/接種的外植體數目）×100%；

愈傷組織誘導率=（接種四周后愈傷組織數目/接種的外植體數目）×100%；

愈傷組織分化率=（誘導出的叢生芽塊數目/轉接的膨大分生組織塊數目）×100%。

2 結果與分析

2.1 芽基部膨大率及愈傷組織的誘導

將無菌的成熟的種子置于誘導培養基上，黑暗培養4～5 d后，芽基部均出現膨大現象。四個品種在2，4-D濃度為3.0 mg/L的誘導培養基中膨大組織的生長狀態好于其他誘導培養基。如圖1所示，遼甜4號和遼甜7號芽基部膨大率較高，分別為100%和98%，并且生長狀態較好，出現愈傷組織；遼甜1號和遼甜5號芽基部膨大率相對較低，分別為84%和88%，并且膨大組織部分出現褐化現象，生長狀態較差。

2.2 愈傷組織的繼代

將生長良好的愈傷組織轉移到含有低濃度KT的繼代培養基上，繼代時需將誘導時留著的種子部分切除，減少褐化，每2周繼代一次，共繼代2次，繼代過程中愈傷組織形成率有明顯的差異。如圖2所示，遼甜4號和遼甜7號愈傷組織生長良好，體積明顯增大，且愈傷組織結構致密，顏色呈淡黃色，愈傷組織最終誘導率分別為92%和89%；遼甜1號和遼甜5號愈傷組織最終誘導率分別為36%和24%，并且遼甜1號愈傷組織質地堅硬生長緩慢，而遼甜5號愈傷組織出現了水漬化和褐化問題。

2.3 再生植株的形成

將最終得到的愈傷組織轉移到分化培養基上，5～6 d后愈傷組織表面出現綠色，1～2周后愈傷組織表面出現綠色芽點，3～4周后生長出不定芽。遼甜4號和遼甜7號最終分化率分別為76%和48%，而遼甜1號和遼甜5號分別為12%和9%。將不定芽轉移至生根培養基中，4～6周后得到完整植株。

3 討論

3.1 外植體的選擇與處理

甜高粱再生體系的建立中，外植體的選擇與處理是誘導初期的關鍵步驟。本研究選用成熟種子，取材方便，不受時空限制。待其芽長到2 cm左右時（約4～5 d），芽基部漸漸出現膨大，將其芽軸及芽尖切除，并保留膨大部分和胚乳部分3～5 d，待芽基部愈傷組織穩定形成后，再將胚乳部分切除。此方法使胚性愈傷組織形成率提高了17%，但胚乳部分也不能長時間保留，營養耗盡后，顏色加深，出現干癟現象，此時要及時去除。

對比發現，直接切除胚乳部分的外植體，極易出現水漬狀，最終褐化。同時，若種子胚乳部分與膨大部分接觸點出現了黑色褐化，要及時將種子胚乳部分去除，減少褐化。

3.2 組織培養過程中的褐化問題

研究表明，若離體材料較小，極易出現褐化，外植體受傷害程度如切口面積過大也會加重褐變程度。本研究對外植體的處理中，胚乳部分的切除與否也會影響褐化程度，導致這種現象的原因除了離體材料大小及切口面積外，也可能因為胚乳里面含有相應的生長激素或酶類，減少了褐化，有利于愈傷組織的形成，對新生組織有一定的保護作用。在繼代時發現有些愈傷組織出現褐化，但未接觸培養基的愈傷組織正常生長，下面部分出現了褐化現象，可能是組織的一種自我保護，確保了上面的愈傷組織正常生長，有些愈傷組織出現水漬狀，這種愈傷組織不再具有分化能力，可通過提高瓊脂的濃度來改善。

3.3 不同品種間組織培養與再生能力比較

不同品種的甜高粱在組織培養及再生能力方面存在差異。四個遼甜品種中，遼甜4號的愈傷組織誘導效率高、生長較快、結構緊密、顏色淡黃，且遼甜4號無論在初始分生組織膨大率、愈傷組織誘導率和愈傷組織分化率上都高于其他遼甜品種。這可能是由于不同品種的基因型不同。

4 結論

本研究以能源專用甜高粱遼甜系列品種成熟種子為材料，建立并改進了甜高粱再生體系，發現誘導培養基中種子發芽2 d后出現膨大，芽長達到2 cm左右時，剪掉其余芽組織，有利于胚性愈傷組織的形成，在愈傷組織穩定形成后，去除種子的胚乳部分，可以減輕褐化和水漬化；同時篩選適宜組織培養的遼甜系列品種，發現遼甜4號品種具有更高的再生能力，更易于組織培養和遺傳轉化。

參考文獻

[1]汪家灼.甜高粱雜交種——新的生物質能源[J].內蒙古農業科學，2007（3）：75-76.

[2]葛玉紅.甜高粱再生體系的優化研究[D].廣西：廣西大學農學院，2011.

（責任編輯：劉昀）