釀酸茶釀制過程中生化成分變化趨勢分析

任翠娟 潘杰 陳秀玲 周家爽 姜金仲

摘要：【目的】研究釀酸茶釀制過程中生化成分變化趨勢，為優化釀酸茶釀制工藝提供參考依據。【方法】將粗老茶鮮葉洗凈晾干，等量（300 g）放入8個泡菜壇中，加入2.5 L冷開水，再分別加入5、10、15、20、25、30、35和40 g蔗糖（編號1～8號），水密封壇蓋后置于陰涼處避光釀制，以新鮮包菜為對照（9號）；每隔7 d測定1次釀制品的亞硝酸鹽、茶多酚、茶氨酸含量及釀制液pH，并對生化成分及影響因素進行相關性分析。【結果】整個釀制過程中，8個試驗組及對照組釀制品的亞硝酸鹽含量隨釀制時間的延長總體上呈下降趨勢；釀制液pH隨蔗糖添加量的增加而降低，14 d后基本趨于穩定；除6號和8號外，其他試驗組釀制品茶多酚含量均隨釀制天數的增加呈下降趨勢；試驗組及對照組釀制品的茶氨酸含量隨釀制時間的延長呈波動式降低趨勢，但隨蔗糖添加量的增加而增加。釀制至21 d時，以蔗糖添加量為30 g的6號釀制品亞硝酸鹽含量及pH最低，茶多酚和茶氨酸含量最高，釀制效果最佳。釀制品亞硝酸鹽含量與釀制時間、蔗糖添加量呈負相關；釀制品茶氨酸含量與釀制時間、蔗糖添加量均呈正相關；釀制液pH與釀制品茶多酚、茶氨酸含量間分別呈極顯著（P<0.01，下同）和顯著（P<0.05，下同）負相關；茶多酚與茶氨酸含量間呈顯著正相關；蔗糖添加量與釀制液pH呈極顯著負相關，與釀制品茶多酚含量呈極顯著正相關。【結論】粗老茶葉以料液比1∶8.3加冷開水、料糖比10∶1添加蔗糖后經21 d釀制，制得的釀酸茶茶多酚和茶氨酸含量無明顯減少，亞硝酸鹽含量低，是一種營養價值較高、極具推廣潛力的特色茶飲。

關鍵詞： 釀酸茶；酸茶；亞硝酸鹽；茶氨酸；茶多酚

中圖分類號： S571.109 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1749-06

0 引言

【研究意義】釀酸茶是以粗老茶鮮葉為原料，經乳酸菌發酵生產的新型茶葉。本課題組前期研究發現，釀酸茶較傳統加工工藝得到的粗老茶葉產品具有顯著優點，其營養及生物活性物質含量高，微生物的發酵作用增加粗老鮮茶葉營養物質（茶多糖、茶氨酸、維生素等）的水溶性，從而提高粗老茶鮮葉營養成分的利用率；除具有茶葉的風味外，由于發酵過程的不同，還產生多種特有的風味；此外，具有清熱解暑、健脾開胃、幫助消化、增加食欲等功效。因此，研究釀酸茶釀制過程中生化成分的變化趨勢，對優化釀酸茶釀制工藝以提高粗老茶鮮葉的加工附加值具有重要意義。【前人研究進展】酸茶最早起源于德昂族（也有說起源于布朗族），已有數百年的制作及飲用歷史，酸茶除具有茶葉的清香味外，還有酸甜可口的滋味，長期飲用能促進消化，有益健康。酸茶的制作方法為先將新鮮茶葉放在鐵鍋中炒熟，然后裝入帶綠色的新鮮竹筒里，將竹筒口封緊，放置1個月左右即成（大南江和伍紹云，2002）；還有一種方法是將新鮮茶葉炒熟后，用新鮮的芭蕉葉包起來，埋入土中，與腌制酸菜一樣腌制1個月左右即成（李淳信，2008）。張楊和薛曉霆（2009）研究了德昂族不同級別酸茶主要內含成分間的差異，結果表明，不同級別酸茶內含成分含量明顯不同，內含成分與品質密切相關。韓麗等（2011）對布朗族酸茶理化及香氣成分進行了研究，結果表明，布朗族酸茶的加工工藝使茶葉外形、色澤、香氣、滋味等均發生劇烈變化，此變化起因于酸茶的水浸物、氨基酸、茶多酚、咖啡堿、黃酮類物質及水溶性糖等主要生化物質含量發生了明顯變化。【本研究切入點】釀酸茶與德昂族酸茶的不同之處在于：德昂族酸茶是先炒熟滅菌，然后固態發酵；釀酸茶是利用新鮮茶葉，不經滅菌，直接進行液態發酵；釀酸茶利用酸菜腌制工藝腌制酸茶，比德昂族酸茶的腌制工藝簡單且衛生。釀酸茶能否成為消費者接受的特色飲料，取決于其釀制過程中主要生化成分（亞硝酸鹽、茶多酚、茶氨酸）的變化結果，但目前尚無相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】研究釀酸茶釀制過程中生化成分的變化趨勢及影響因素，并對釀酸茶生化成分及其影響因素進行相關性分析，為優化釀酸茶釀制工藝提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

粗老茶鮮葉（1芽4、5葉以上新梢的所有葉片）于2014年5月采摘自貴陽市朱昌鎮高寨茶場，采后經清水洗凈、剔除雜質、晾干后備用。亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、磷酸鹽、酒石酸鐵為化學純，對氨基苯磺酸和茚三酮為分析純。主要儀器設備：玻璃泡菜壇、電熱恒溫水浴鍋、紫外可見分光光度計、電熱鼓風干燥箱、電子天平、pH計、抽濾機、干燥器、粉碎機。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 釀酸茶釀制方案 參考德昂族酸茶（大南江和伍紹云，2002；李淳信，2008）和普通泡菜（李金紅，2002）的制作方法，釀酸茶的釀制過程符合國家食品衛生標準。取9個洗凈的透明玻璃泡菜壇，分別編號1～9號。稱取5、10、15、20、25、30、35和40 g蔗糖分別置于1～8號泡菜壇中，再加入300 g粗老茶鮮葉和2.5 L冷開水。9號泡菜壇（對照組）加入20 g蔗糖和2.5 L冷白開水后，加入市售新鮮包菜300 g。用保鮮膜封住所有壇口，蓋上壇蓋，再用水密封壇蓋，置于陰涼處避光釀制。釀制過程中，每7 d打開壇蓋取樣1次，進行釀制品（經釀制后烘干的粗老茶葉）及釀制液（用于釀制釀酸茶的母液）生化成分含量測定，取樣后立即密封壇蓋。

1. 2. 2 釀制品亞硝酸鹽含量測定 參照GB 5009.33- 2010進行測定。稱取5.00 g釀制品（75 ℃烘干至恒重，下同）粉碎后制成勻漿試樣（如制備過程中加水，應按加水量折算），置于50.0 mL燒杯中，加入12.5 mL飽和硼砂溶液，攪勻后用300.0 mL約70 ℃水將試樣洗入500.0 mL容量瓶中，于沸水浴中加熱15 min，取出冷水冷卻，并放置至室溫。在振蕩上述提取液的同時，加入5.0 mL亞鐵氰化鉀溶液，再加入5.0 mL乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質；然后加水定容至500.0 mL，搖勻，放置30 min，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾，棄去初濾液30.0 mL，濾液備用。吸取40.0 mL上述濾液置于50.0 mL帶塞比色管中，分別在對照管與試樣管中加入2.0 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后各加入1.0 mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至比色管刻度，混勻，靜置15 min，用2 cm比色杯，以零管調節零點，于538 nm波長處測吸光值。

1. 2. 3 釀制液pH測定 采用酸度計測定。用潔凈的移液管從泡菜壇中吸取少量釀制液于小燒杯中，將pH計探頭浸入小燒杯中進行測定。

1. 2. 4 釀制品茶多酚和茶氨酸含量測定 參照GB/T 8302-2002、GB/T 8303-2002、GB/T 8314-2002、GB/T 8312-2002和GB/T 8313-2002進行測定。從1～9號泡菜壇中依次取出釀制品用粉碎機研磨成細粉（60目），得釀制品粉末，將其編號，裝入潔凈容器中備用。

1. 2. 4. 1 茶多酚測定 準確稱取釀制品粉末3.00 g，加沸水450.0 mL，在沸水浴中浸提45 min，每隔10 min搖1次；水浴后趁熱抽濾，殘渣用熱蒸餾水洗2～3次，濾液冷卻后定容至500.0 mL容量瓶中。吸取樣品溶液1.0 mL置于25.0 mL容量瓶中，加4.0 mL蒸餾水和5.0 mL酒石酸鐵溶液，搖勻，再加入pH 7.5磷酸緩沖液稀釋至刻度。以蒸餾水為空白對照，選擇540 nm波長和10 mm比色杯測定吸光值。

1. 2. 4. 2 茶氨酸測定 準確稱取釀制品粉末3.00 g，加沸水450.0 mL，在沸水浴中浸提45 min，每隔10 min搖1次；水浴后趁熱抽濾，殘渣用熱蒸餾水洗2～3次，濾液冷卻后定容至500.0 mL容量瓶中。準確吸取1.0 mL試液，置于25.0 mL容量瓶中，加入0.5 mL pH 8.0磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15 min，待冷卻后加水定容至25.0 mL。放置10 min后，用5 mm比色杯，以蒸餾水為空白對照，在570 nm處測定吸光值。

1. 2. 5 相關分析 為了探討釀制品中各生化成分間的相互關系，以及生化成分與釀制影響因素間的相互關系，對這些指標進行相關性分析。

1. 3 統計分析

采用DPS 3.01和Excel 2003對試驗數據進行統計分析。本研究的生化成分分析采用吸光值變化趨勢分析（除pH），因吸光值與生化成分間呈正相線性關系，故吸光值的變化趨勢即代表生化成分含量的變化趨勢。

2 結果與分析

2. 1 釀制時間及蔗糖添加量對釀制品亞硝酸鹽含量的影響

釀制品亞硝酸鹽吸光值隨釀制時間的變化情況見圖1。由圖1可知，在釀制前14 d，對照組9號釀制品的亞硝酸鹽含量呈上升趨勢，而試驗組2～8號呈下降趨勢，說明釀酸茶較果蔬泡菜類不易在釀制品中積累亞硝酸鹽。試驗組中，7號釀制品的亞硝酸鹽含量在釀制至第14 d時最低，1號的含量在釀制至第28 d時最高。對照組釀制7～14 d時，釀制品亞硝酸鹽含量上升速度較快，釀制14～21 d時，呈下降變化趨勢，之后又上升，28 d后趨于穩定。釀制結束時，1～9號釀制品的亞硝酸鹽含量較釀制7 d時分別減少了10.00%、20.55%、23.08%、38.04%、30.00%、36.67%、45.71%、32.47%和29.89%。

釀制品中蔗糖添加量對亞硝酸鹽的產生有一定影響（圖1）。釀制至21 d時，試驗組1號釀制品的亞硝酸鹽含量呈波動式上升變化趨勢，試驗組2～8號呈波動式下降趨勢；其中5號（25 g蔗糖）亞硝酸鹽含量最低，其次為6號（30 g蔗糖）。釀制結束時，試驗組以2號釀制品的亞硝酸鹽含量最高。釀制至21 d時，當蔗糖添加量大于10 g，隨蔗糖添加量的增加，亞硝酸鹽含量呈下降趨勢，說明蔗糖濃度較高時可抑制耐滲透壓能力較弱的微生物，使硝酸鹽還原生成亞硝酸鹽的量減少；蔗糖濃度較低則無法完全抑制硝酸還原菌的生長，反而為釀制過程提供能量，亞硝酸鹽生成量增多。

2. 2 釀制時間及蔗糖添加量對釀制液pH的影響

在釀制液中加入糖類物質，可為乳酸菌的繁殖提供足夠的碳源和能源，從而產生大量有機酸。由圖2可知，試驗組1、2號釀制液pH在4.269～4.799范圍內波動，明顯高于其他試驗組；而對照組pH（2.990～3.020）最低。總體來說，釀制21 d后，試驗組和對照組pH均隨著釀制時間的延長逐漸趨于穩定；說明釀制21 d后，乳酸菌的活動已達到最大。

從圖2還可知，試驗組釀制液pH與蔗糖添加量呈負相關，隨著蔗糖添加量的增加，pH逐漸下降，酸性逐漸增強。釀制至21 d，試驗組1號（5 g蔗糖）和2號（10 g蔗糖）釀制液pH高于其他試驗組；在試驗組3號（15 g蔗糖）～8號（40 g蔗糖），隨著蔗糖添加量的增加，釀制液pH依次呈逐漸下降趨勢。

2. 3 釀制時間及蔗糖添加量對釀制品茶多酚含量的影響

粗老茶葉在釀制液中浸泡釀制時，會有茶多酚從茶葉中浸出，若其浸出量過多，就會使茶葉味道變淡，質量降低。從圖3可看出，釀制21 d，除6號和8號釀制品外，其他試驗組釀制品茶多酚含量均隨釀制時間的延長呈下降趨勢；第21 d時，6號和8號釀制品茶多酚含量達峰值，21 d后開始下降，以試驗組6號茶多酚含量最高。整個釀制過程中，對照組茶多酚含量明顯低于試驗組，但在21 d前有小幅上升，可能是釀制過程中泡菜有其他酚類物質產生。釀制21 d后，除2號釀制品茶多酚含量在28 d后上升外，其他釀制品的茶多酚含量均呈下降趨勢。

釀制品茶多酚吸光值隨蔗糖添加量變化的情況見圖3。由圖3可知，釀制至21 d時，隨著蔗糖添加量的增加，試驗組釀制品茶多酚含量整體呈上升趨勢，2～8號釀制品茶多酚含量比試驗組1號分別高了10.69%、41.82%、26.73%、52.52%、79.56%、53.77%和77.36%，以試驗組6號釀制品（30 g蔗糖）的茶多酚含量最高。可見，加入蔗糖量不同，釀制品茶多酚含量也不同，但對釀制品茶多酚含量均有一定的保留作用。

2. 4 釀制時間及蔗糖添加量對釀制品茶氨酸含量的影響

茶氨酸含量是衡量茶葉品質的一個重要指標，一般茶氨酸含量越高，茶葉品質越好。粗老茶葉釀制過程中會有茶氨酸浸出，由于釀制作用導致蛋白質分解也會有新的茶氨酸生成，這種浸出及生產構成了釀制品中茶氨酸含量的動態變化，找到動態中的最佳點對于優化釀酸茶的釀制工藝具有指導作用。由圖4可知，釀制7 d時，對照組釀制品的茶氨酸含量最高，之后呈波動式下降趨勢。釀制7～14 d，所有試驗組釀制品的茶氨酸含量均呈下降趨勢，第14～21 d呈上升趨勢，第21～35 d又呈下降趨勢。釀制至21 d時，試驗組6號釀制品的茶氨酸含量高于其他試驗組釀制品。因此，從追求高茶氨酸含量的角度出發，釀制的最佳時間為21 d，最佳試驗組為6號。

蔗糖添加量對釀制品茶氨酸含量的影響見圖4。釀制至21 d時，試驗組2～8號釀制品的茶氨酸含量比試驗組1號分別高了19.26%、19.26%、26.23%、22.95%、42.21%、15.16%和28.28%，說明隨蔗糖添加量的增加，所有釀制品茶氨酸含量呈總體上升的變化趨勢，其中試驗組6號釀制品（30 g蔗糖）茶氨酸含量最高。

2. 5 釀酸茶釀制過程中生化成分及影響因素間的相互作用分析

由表1可看出，釀制品茶多酚含量與茶氨酸含量間呈顯著正相關（P<0.05，下同），釀制液pH與茶多酚、茶氨酸含量間分別呈極顯著（P<0.01，下同）和顯著負相關，將pH換成酸度，則是溶液酸度與茶多酚及茶氨酸含量間分別呈極顯著和顯著正相關，即溶液酸度越高，茶多酚和茶氨酸含量也越高。

為了探討釀制液pH、釀制品茶多酚、茶氨酸及亞硝酸鹽含量與釀制時間、蔗糖添加量間的相互關系，對這些指標進行相關性分析，結果見表2。由表2可知，蔗糖添加量與釀制液pH呈極顯著負相關，即隨著蔗糖添加量的增加，釀制液pH相應降低；同時，蔗糖添加量與釀制品茶多酚含量呈極顯著正相關，即隨著蔗糖添加量的增加，釀制品茶多酚含量增加。釀制時間與釀制液pH和釀制品茶氨酸含量呈正相關，與釀制品茶多酚和亞硝酸鹽含量呈負相關，但均未達顯著水平（P>0.05）。

3 討論

3. 1 釀制品亞硝酸鹽含量的變化

釀酸茶釀制過程中，釀制品的亞硝酸鹽含量與釀制時間、蔗糖添加量呈負相關，說明釀制品亞硝酸鹽含量隨釀制時間的延長和蔗糖添加量的增加而降低；其中蔗糖添加量為30 g的6號釀制品亞硝酸鹽含量在整個釀制過程中比其他釀制品（5號除外）相對較低，對照組釀制品亞硝酸鹽含量在整個釀制過程中高于試驗組，但釀制至21 d時，試驗組和對照組釀制品亞硝酸鹽含量均降至最低值。該研究結果與禹利君等（2008）、韓麗等（2011）的研究結果基本一致；釀制品亞硝酸鹽含量在釀制過程中隨釀制時間延長而降低，并在21 d時達最低值，而此時釀制品有利成分相對較高，使釀制品既有較好的營養保健價值，又保證了飲用安全。

3. 2 釀制液pH及釀制品有益生化成分含量的變化

茶多酚和茶氨酸是釀制品的重要營養物質，其含量越高，釀制品的品質越好。本研究中，釀制液pH與釀制品茶多酚、茶氨酸含量間分別呈極顯著和顯著負相關，而茶多酚含量與茶氨酸含量間呈顯著正相關。說明在釀制過程中，釀制品的茶多酚和茶氨酸具有相同的水溶性，當釀制液pH較高時，茶多酚和茶氨酸容易從釀制品中溶出，pH較低時，則難以溶出。從保留釀制品營養成分含量考慮，釀制液pH越低越好。

蔗糖添加量與釀制液pH呈極顯著負相關，與釀制品茶多酚含量呈極顯著正相關，與亞硝酸鹽含量呈負相關。釀制品的茶多酚含量是粗老茶葉原料中所固有，不會因釀制過程而增加，只會減少或不變；故釀制品茶多酚含量隨蔗糖添加量的增加而增加的現象可以理解為釀制品的茶多酚在釀制液pH較高時（蔗糖添加量較少的試驗組pH較高）溶出率較高，從而導致蔗糖添加量較少的試驗組釀制品茶多酚含量降低；即蔗糖通過改變釀制液pH對茶多酚含量產生影響。在一定的蔗糖添加量范圍內，蔗糖可以促進釀制微生物的生長，分泌更多的有機酸，從而降低釀制液的pH，進而抑制亞硝酸還原菌等厭氧菌生長，使亞硝酸鹽含量整體呈下降趨勢。

釀制時間與釀制品茶多酚和亞硝酸鹽含量間呈負相關，說明釀酸茶釀制過程中，釀制品茶多酚和亞硝酸鹽含量隨釀制時間的延長而降低；茶多酚含量下降會降低釀制品的質量，而亞硝酸鹽含量降低會提高釀制品的質量。因此，釀制時間對于釀制品質量的影響呈雙向性，實際操作時須慎重選擇最佳時間點，且最佳釀制時間點也有待進一步研究。

釀制品茶氨酸含量與釀制時間及蔗糖添加量間均呈正相關，說明釀制時間的延長及蔗糖添加量的增加可以提高釀制品的氨基酸含量，釀制品的氨基酸可與多酚類化合物及糖類相互作用生成色澤悅目、具有揮發性的香氣物質，參與釀酸茶色澤和香氣的形成（李志光等，2002）。茶葉游離氨基酸含量決定茶葉的鮮爽味，鮮爽味決定茶葉的品質和價值；因此，茶氨酸含量呈上升趨勢，表明釀制品在釀制過程中的風味、營養價值和口感在不斷提高。在同一釀制時間點上，試驗組6號茶氨酸含量相對較高，釀制至21 d時各試驗組釀制品茶氨酸含量均達最大值。

3. 3 關于釀酸茶比泡菜有較少亞硝酸鹽積累的現象分析

本研究發現，在釀酸茶及泡菜的釀制過程中，釀酸茶比泡菜較不易積累亞硝酸鹽，是一個比較新的現象。推測產生這種現象的可能原因有兩方面：

從化學角度來看，亞硝酸鹽酸性條件下具有一定的氧化性（魏國勤，1987）（2HNO2+2H+=2NO+2H2O3），而酚類物質分子中含有大量的酚羥基，能夠提供活潑的氫質子（孫建霞等，2005），該氫質子可以加速上述亞硝酸鹽的氧化；粗老茶鮮葉中含有豐富的茶多酚，釀酸茶釀制過程中會產生大量乳酸，使溶液pH呈酸性。因此，釀酸茶釀制過程具備完成亞硝酸鹽氧化反應的條件，從而導致釀酸茶亞硝酸鹽含量的降低。

從生物發酵角度來看，發酵體系中雜菌數量是影響體系中亞硝酸鹽含量的重要因素之一（鄒輝等，2013）。一般情況下，雜菌越多，亞硝酸鹽含量越高。粗老茶葉中含有豐富的茶多酚和茶皂甙，二者均有明顯抑制雜菌的作用（董璐等，2014），從而導致釀酸茶亞硝酸鹽含量降低。

4 結論

粗老茶葉以料液比1∶8.3加冷開水、料糖比10∶1添加蔗糖后經21 d釀制，制得的釀酸茶茶多酚和茶氨酸含量無明顯減少，亞硝酸鹽含量低，是一種營養價值較高、極具推廣潛力的特色茶飲。

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（責任編輯 羅 麗）