黑格爾七彩神仙魚摩氏摩根菌分離鑒定及耐藥性分析

王磊 孫培英 陳再忠 羅小溪 高建忠 李仲璞 韓靈莉

摘要：【目的】對患病七彩神仙魚進行摩氏摩根菌（Morganella morganii）分離鑒定及藥敏試驗，為七彩神仙魚養殖過程中摩氏摩根菌感染的臨床診斷和科學用藥提供科學依據。【方法】從患病野生黑格爾七彩神仙魚體表分離病原菌，然后對其進行形態觀察、生理生化指標測定及16S rDNA序列分析，并采用紙片擴散法（K-B）進行藥敏試驗。【結果】從患病野生黑格爾七彩神仙魚分離獲得一株優勢菌株（DS2015），該菌為革蘭氏陰性桿菌，其生理生化測定結果與摩氏摩根菌的相似度達100%。菌株DS2015的16S rDNA序列1208 bp（GenBank收錄號KR866070），由基于16S rDNA序列構建的系統發育進化樹可知，菌株DS2015與摩氏摩根菌聚為一簇，Bootstrap檢驗值為99；Biolog微生物自動鑒定結果也顯示，菌株DS2015最具可能性為摩氏摩根菌。藥敏試驗結果表明，菌株DS2015對慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復方新諾明等抗生素高度敏感，對米諾環素中度敏感，對青霉素G、頭孢氨芐、頭孢拉定、四環素、多西環素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素和呋喃唑酮等抗生素已產生耐藥性。【結論】摩氏摩根菌可引起七彩神仙魚身體發黑、皮膚大量分泌黏液及鰭條潰爛等癥狀，嚴重者甚至引起死亡，生產中可選用慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復方新諾明等抗生素進行防治。

關鍵詞： 七彩神仙魚；摩根氏菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號： S941.42 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1772-06

0 引言

【研究意義】七彩神仙魚（Symphysodon spp.）隸屬于慈鯛科（Cichlidae）盤麗魚屬（Symphysodon），原產于南美亞馬遜河流域（劉曉東和陳再忠，2008），因其體色鮮艷奪目、花紋變幻，被譽為熱帶魚之王（Giovanetti and Lucanus，2001）。近年來，我國七彩神仙魚雖已實現人工養殖，但每年仍需從原產地進口大量野生魚種進行品系改良，以期對退化的七彩神仙魚種質資源進行復壯。進口野生七彩神仙魚價格昂貴，是人工養殖七彩神仙魚價格的十余倍，且死亡率極高，嚴重挫傷七彩神仙魚養殖戶的生產積極性，對其產業發展構成嚴重威脅（孫悅等，2013）。此外，七彩神仙魚對水質要求較高（適宜生活水溫28～32 ℃，pH 5.5～6.5，硬度1.4～1.8 mmol/L），飼養管理稍有不慎就會引起代謝紊亂、免疫力下降，且其體表鱗被較細、黏液分泌豐富，極易感染各種細菌性、真菌性和寄生蟲性疾病（Onal et al.，2011；EI-Ghany et al.，2014）。因此，加強七彩神仙魚的病害研究對促進其養殖產業健康發展具有重要意義。【前人研究進展】細菌性病原感染是七彩神仙魚運輸和養殖過程中的常見疾病，但至今關于七彩神仙魚細菌性疾病方面的研究極少，僅EI-Ghany等（2014）報道了嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）可引起七彩神仙魚感染發病。摩氏摩根菌（Morganella morganii）隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）摩氏摩根菌屬（Morganella）。一般認為摩氏摩根菌是腐生菌，通常存在于人類和其他動物的糞便及污水、土壤中，特別是動物蛋白腐爛的地方（李雪峰和王利，2015），為條件性致病菌，可感染多種養殖動物而致病，我國已從多種患病動物上分離到該菌，包括錦鯉（陸小萏等，2005；韓娜娜等，2013）、袋鼠（趙耘等，2010）、黃喉擬水龜（黎小正等，2010）、中華鱉（孔蕾等，2013）等。陸小萏等（2005）和韓娜娜等（2013）報道，摩氏摩根菌可引起錦鯉肌肉充血、潰瘍，嚴重者甚至引起死亡。黎小正等（2010）研究發現，摩氏摩根菌可引起養殖黃喉擬水龜發病死亡，臨床癥狀表現為食欲減少、流鼻涕、嘴角有滲出物、口腔潰瘍、眼睛有分泌物。李瑞偉等（2014）報道，摩氏摩根菌可引起中國大鯢腹部膨脹，體表有出血點，解剖后發現患病大鯢腹腔有大量積水，肝臟出血，腎臟失血發白，腸壁毛細血管充血。李雪峰和王利（2015）研究表明，鱸魚感染摩氏摩根菌后其鱗片脫落，鰭基及魚體兩側輕度出血，肛門紅腫，脾臟腫大。【本研究切入點】目前，有關摩氏摩根菌感染引起七彩神仙魚發病的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】對患病七彩神仙魚進行摩氏摩根菌分離鑒定及藥敏試驗，以期為七彩神仙魚養殖過程中摩氏摩根菌感染疾病的臨床診斷和科學用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患病黑格爾七彩神仙魚由上海某七彩神仙魚進口商從巴西亞夢達河（Rio Nhamunda）流域進口（圖1），其臨床癥狀表現為鰭條潰爛，體表黏液脫落，呼吸急促，食欲不振等。健康七彩神仙魚由上海海洋大學水產與生命學院觀賞水族實驗室自行繁殖獲得，體長7.2±0.4 cm，體重23.54±2.15 g。細菌生化反應微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1. 2 細菌分離純化

用無菌棉簽在魚體表刮取受傷部位的黏液，稀釋后接種于營養瓊脂培養基上，（28.0±0.5）℃培養24 h后挑取單個菌落，純化2次以獲得純培養菌株（命名為DS2015）。觀察分離培養菌落形態特征，并進行革蘭氏染色、顯微鏡檢，觀察細菌的形態和染色特征，將純化的菌株接種于試管斜面培養基保存、備用。

1. 3 生理生化及藥敏試驗

采用細菌生化反應微量鑒定管進行菌株DS2015的各項生理生化指標測定，并以紙片擴散法（K-B）進行藥敏性試驗。將菌株DS2015接種于新鮮營養肉湯培養基，（30.0±0.5）℃下搖床（200 r/min）培養24 h后用生理鹽水稀釋至OD=0.6左右，取200 μL新鮮菌懸液（濃度約1×107 CFU/mL）均勻涂布于BHI培養基上；在無菌操作下，將10類20種常用抗生素的抗藥敏紙片均勻貼在BHI培養基上，每種抗藥敏紙片3個重復，（30.0±0.5）℃培養24 h后測量抑菌圈直徑。

1. 4 16S rDNA的PCR擴增及測序分析

將營養肉湯培養過夜的菌株8000 r/min離心2 min后，用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌總DNA。用于PCR擴增的引物為通用引物（正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系50.0 μL，即PCR Master Mix（2×） 25.0 μL，正、反向引物（0.2 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，重蒸水22.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像儀下觀察結果。同時將PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序所得菌株16S rDNA序列通過NCBI的BLAST檢索系統進行序列同源性分析。選取同源性最近的序列通過MEGA 5.0進行比對分析，并構建系統發育進化樹。

1. 5 Biolog微生物自動鑒定

挑取單個純化菌株接種于Biolog專用IF-A培養液中，配成一定濃度的菌懸液后用濁度計進行校準，使其濃度在標準要求范圍內，然后倒入無菌的一次性V型加樣槽中，使用Biolog專用移液排槍將菌懸液按每孔100 μL加到GenIII微孔板的96個孔內，標記后恒溫（33 ℃）生化培養16～24 h，將鑒定板裝載于Biolog系統中培養，系統自動讀數并輸出鑒定結果。

1. 6 動物感染試驗

將菌株DS2015接種于LB液體培養基29 ℃培養12 h，取0.5 mL菌懸液用生理鹽水稀釋至1.0×108和1.0×109 CFU/mL。感染試驗采用腹腔注射法，每個濃度梯度注射12尾七彩神仙魚，每尾注射菌液0.1 mL，對照組注射0.1 mL無菌生理鹽水。注射后的七彩神仙魚養殖于自動充氣水族箱中（100 cm×50 cm×40 cm），飼養水溫（28.0±0.5）℃，養殖期間停止喂食，日換水量為50%，連續觀察7 d并記錄試驗結果。

1. 7 統計分析

以Excel 2007和SPSS 18.0進行數據統計分析，并采用t 檢驗進行組間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 病原菌的菌落形態特征及其培養特性

由圖2可看出，病原菌在營養瓊脂培養基上生長良好，其菌落呈圓形，表面光滑、邊緣整齊、中央隆起，乳白色；菌落直徑0.9～1.2 mm，生長豐盛。革蘭氏染色呈陰性，單個菌體呈桿狀、散在、兩端鈍圓。

2. 2 病原菌的生理生化特性

菌株DS2015的生理生化測定結果與摩氏摩根菌（M. morganii）的相似度達100%，初步確認該菌株為摩氏摩根菌，具體生理生化指標測試結果見表1。

2. 3 16S rDNA序列分析及系統進化樹分析結果

菌株DS2015的16S rDNA序列為1208 bp，將其提交至GenBank，獲得收錄號KR866070；通過NCBI的BLAST比對分析，發現菌株DS2015的16S rDNA序列與GenBank中已公布摩氏摩根菌不同菌株16S rDNA 序列的相似性均在99%以上。從GenBank中選取10株摩氏摩根菌標準菌株的16S rDNA序列構建系統發育進化樹，結果發現菌株DS2015與摩氏摩根菌聚為一簇（圖3），Bootstrap檢驗值為99，可進一步確定菌株DS2015為摩氏摩根菌。

2. 4 Biolog微生物自動鑒定結果

恒溫生化培養16～24 h后，其鑒定結果發現綠色ID 框顯示“Species ID”，即菌株DS2015得到匹配好的結果（圖4）。Biolog微生物自動鑒定結果表明，菌株DS2015最具可能性為摩氏摩根菌。

2. 5 動物感染試驗結果

分別以1.0×108和1.0×109 CFU/mL的菌懸液感染七彩神仙魚，人工感染4 h后七彩神仙魚游動遲緩，12 h后出現死亡現象，48 h后七彩神仙魚死亡率為42%～

63%。對照組的七彩神仙魚無任何癥狀。人工感染發病七彩神仙魚體表分泌大量黏液，以死亡七彩神仙魚體表黏液為材料進行細菌分離，再經生物學特征鑒定，結果發現其特征特性與菌株DS2015完全相同，說明菌株DS2015是引起七彩神仙魚發病的致病菌。

2. 6 藥敏試驗結果

選取20種抗生素對菌株DS2015進行藥敏試驗，結果發現其對慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復方新諾明等10種抗生素高度敏感，對米諾環素中度敏感，對青霉素G、頭孢氨芐、頭孢拉定、四環素、多西環素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素和呋喃唑酮等9種抗生素已產生耐藥性（表2）。

3 討論

摩氏摩根菌是一種條件性致病菌，可感染多種養殖動物而致病， 引起感染動物肺臟淤血、膿腫，腎臟出血等內臟器官病變及體表皮膚、肌肉潰爛。近年來，因摩氏摩根菌引起的水產動物疾病日趨嚴重。目前已有研究從患病大鯢、錦鯉、草魚、鱸魚等水生生物體內分離鑒定出摩氏摩根菌，其發病癥狀主要表現為皮膚潰爛、肌肉充血、內臟器官病變（Holt et al.，1994；陸小萏等，2005；俞春紅等，2012；李雪峰和王利，2015）。本研究從患病七彩神仙魚體內分離獲得摩氏摩根菌，病魚臨床表現出身體發黑、皮膚大量分泌黏液及鰭條潰爛等癥狀，與摩氏摩根菌引起其他魚類的感染癥狀相似。

目前，水產養殖動物疾病仍是采用抗生素來控制其發生和流行，但化學藥物防治極易導致病原菌產生耐藥性（李瑞偉等，2014）。本研究的藥敏試驗結果表明，菌株DS2015對多數抗生素不敏感，可能與目前野生七彩神仙魚在進口運輸和暫養過程中常大量使用硝基呋喃類、四環素類和青霉素類抗生素以預防細菌性疾病的發生有關。七彩神仙魚源摩氏摩根菌與其他水生生物源摩氏摩根菌的藥敏結果存在明顯差異。陸小萏等（2005）研究表明，錦鯉摩氏摩根菌對氧氟沙星等抗生素敏感，但對生產上的一些常規抗菌藥物如青霉素類、慶大霉素、磺胺類等不敏感；孔蕾等（2013）對中華鱉摩氏摩根菌進行藥敏試驗，發現其對氨曲南、氟苯尼考、頭孢哌酮等藥物敏感；韓娜娜等（2013）研究發現，錦鯉摩氏摩根菌對先鋒霉素、萬古霉素、青霉素等已產生耐藥性，對頭孢曲松、奧復星、復方新諾明等敏感；蘭云等（2014）研究表明，從黃喉擬水龜分離獲得的摩氏摩根菌對哌拉西林、頭孢哌酮、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素高度敏感；李瑞偉等（2014）研究表明，從患病大鯢分離獲得的摩氏摩根菌對頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南等10種抗菌藥物高度敏感，但對利福平、阿莫西林等表現出較高的耐藥性；李雪峰和王利（2015）研究發現，從患病鱸魚分離獲得的摩氏摩根菌對磷霉素、菌必治等高度敏感，對痢特靈、紅霉素和諾氟沙星中度敏感，對氨芐西林和氟苯尼考等11種抗菌藥物不敏感（耐藥）。這可能與不同患病品種的用藥習慣有密切關系，長期或多次使用的藥物較易產生耐藥性，但具體原因有待進一步探究。

4 結論

摩氏摩根菌可引起七彩神仙魚身體發黑、皮膚大量分泌黏液及鰭條潰爛等癥狀，嚴重者甚至引起死亡，生產中可選用慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復方新諾明等抗生素進行防治。

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（責任編輯 蘭宗寶）