蜜蜂主要病害及其病原PCR檢測研究進展

劉學錄 童金鳳 馬振剛

摘要：蜜蜂疾病已成為制約蜂產品產量提高和蜂產品安全的重要因素，引起蜜蜂疾病的病原種類很多，包括細菌型、真菌型、病毒型及寄生蟲類病害等。文章通過綜述蜜蜂蜂群中四類主要病害（細菌型病害、真菌型病害、病毒型病害和寄生蟲類病害）的致病病原、病癥及其PCR檢測方法，發現由于某些相似病原體間的基因序列具有高度保守性，在實際診斷過程中仍然存在缺乏PCR鑒定靶標、PCR檢測假陽性等問題。因此，今后應著眼于以下幾點，有效解決蜜蜂疾病快速、特異診斷的障礙：（1）篩選單一病原體的特異候選靶標基因，提高PCR檢測結果的特異性；（2）設計并優化針對特異基因片段的引物序列，降低引物錯配率；（3）基于先進的病原檢測方法，建立靈敏度更高的疾病診斷方法；（4）完善LAMP、ELISA、免疫試紙條法等在蜜蜂疾病診斷中的應用。

關鍵詞： 蜜蜂；主要病害；癥狀；PCR檢測

中圖分類號： S895 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）01-0147-06

0 引言

蜜蜂是一類重要的經濟昆蟲，在構建與維持自然生態系統和生態農業、供給人類高級營養和保健功能產品的過程中扮演重要角色（Ren et al.，2014）。我國是養蜂大國，也是世界蜂產品生產和出口大國，每年出口的蜂蜜數量占世界出口總量的20%左右，年均出口創匯達1.4億美元。同時，蜜蜂已經成為一種世界性的重要的經濟模式生物。據聯合國糧食及農業組織（FAO）不完全統計，20世紀60～90年代世界蜜蜂種群數量一直呈上升趨勢（陳黎紅等， 2012）。但蜜蜂在生存過程中，易受各類外界條件威脅，其中蜜蜂傳染性病蟲害因危害程度嚴重、傳播迅速、持續時間長等特點，已成為制約蜂產品產量提高和蜂產品安全的重要因素。世界動物衛生組織（OIE）也將蜜蜂病定為B類法定報告疾?。ú苈擄w等，2006）。在蜂業生產過程中，引起蜜蜂疾病的病原種類很多，包括細菌型、真菌型、病毒型病害等。蜜蜂受到疾病威脅，不僅導致其大量死亡而影響蜂群的生產能力，還伴有傳染性病原微生物污染，蜂產品衛生質量受到影響；此外，在疾病防治過程中常因用藥不當致使藥物殘留，造成蜂產品的雙重污染。傳統的蜜蜂疾病診斷主要依靠肉眼觀察患病蜜蜂的病癥及電鏡觀察分離、純化獲得的病原，其方法耗時長、操作繁瑣且不易進行明確區分，如患歐洲幼蟲腐臭病和中蜂囊狀幼蟲病毒的蜜蜂均可出現“插花子脾”現象。新興的PCR分子檢測技術是在分子水平上，針對不同種病原的分子特異性片段進行擴增鑒定，具有快速、方便、準確等優勢，一直受到蜜蜂疾病診斷研究者的廣泛關注。為此，本文通過綜述蜜蜂主要病害及其病原PCR檢測的研究進展，以期為蜜蜂疾病診斷及病原體快速鑒定方法的建立提供參考依據。

1 細菌型疾病

細菌型疾病是一種嚴重危害蜜蜂蜂群正常生長、發育的傳染性疾病，具有感染時間長、傳播速度快、危害程度大等特點。目前比較具有代表性的蜜蜂細菌型疾病包括：美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病、成蜂螺原體病、敗血病和副傷寒桿病，對應的主要致病病原分別是類幼蟲芽孢桿菌、蜂房蜜蜂球菌、螺原體、蜜蜂敗血假單胞菌和蜂房哈夫尼菌。美洲幼蟲腐臭病和歐洲幼蟲腐臭病屬于蜜蜂幼蟲病，患美洲幼蟲腐臭病的蜜蜂最初會在體色上發生明顯變化，顏色由正常的珍珠白變為棕黃色、褐色甚至黑褐色，房蓋由凸起變為凹陷，且潮濕、顏色變暗，整個房蓋顏色交錯，感染后期用鑷子挑起蟲尸可拉成2～3 cm的細絲，且伴有魚腥臭味（Shimanuki et al.，1980；張其安等，2011）；而患歐洲幼蟲腐臭病的幼蟲體色先呈蒼白色，逐漸變化為黃色，最后呈深褐色，并且可見白色窄條狀背線，死尸無黏稠性但有酸臭味，易被工蜂清除掉而留下空房，其與子房相間形成“插花子脾”現象（孫希國，2014）。蜂螺原體病、敗血病和副傷寒桿病屬于成蜂病，患成蜂螺原體病的蜜蜂行動緩慢，失去飛翔能力，常見三五成群聚集在土洼或草叢中；患敗血病蜜蜂的典型癥狀是染病初期成蜂拒食、煩躁不安、無力飛翔、爬行于箱內外、振翅，最后抽搐、痙攣而死，病死的蜜蜂變色、變軟、腐爛，直至肢節分離（彭文君等，2014）；患副傷寒桿病的病蜂多表現出“大肚型”：患病蜂腹部膨大、虛弱、行動遲緩、無飛翔能力、部分肢節麻痹、下痢，有時也會存在“油光黑蜂型”：病蜂絨毛脫落，頭腹部縮小且似油炸般（洪德興，2000）。

在養蜂生產過程中，蜂業工作者通常使用四環素類抗生素（TCs）對蜜蜂敗血病或美洲幼蟲腐臭病等細菌型疾病進行預防和治療，進而造成蜂產品中TCs藥物殘留。如利用羥四環素（Oxytetracycline，OTC）可實現對美洲幼蟲腐臭病的有效控制，但蜂群儲蜜須經多次搖除后才能有效將OTC殘留量降低到一個相對較低的標準。2002年初，我國蜂產品因氯霉素等抗生素殘留超標而被禁止出口歐盟。因此有必要加快并實現蜜蜂幼蟲病的快速診斷，減少抗生素等藥物的使用。至今，針對蜜蜂主要細菌性疾病的PCR檢測方法已初步建立（表1），如歐洲幼蟲腐臭病可根據針對Melissococcus pluton的16S rRNA基因設計特異性引物開展診斷，其引物特異性強，不與其他DNA產生雜交反應（Govan et al.，1998）；針對蜜蜂螺原體（Spiroplasma melliferum）也建立了一種PCR快速檢測方法，其最低檢測濃度為5～6個/mL（李霞，2012）；針對美洲幼蟲腐臭病檢測則建立了更精確的二溫式PCR檢測方法，其檢測幼蟲芽孢桿菌的DNA靈敏度達33 fg，且重復性良好（何曉杰等，2015）；而針對副傷寒桿病，是根據甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原特異性基因DNA核苷酸序列設計特異性上、下游引物及熒光探針序列（冉燕，2009）。

2 真菌型疾病

真菌型疾病是一種嚴重影響蜜蜂蜂群發展的頑固性傳染病，其發生與多雨、潮濕、溫度不穩定有關，且多見于西方蜜蜂，如白惡病、黃曲霉病均可引起蜜蜂幼蟲死亡。蜜蜂白堊病又名石灰質病，是由蜜蜂球囊菌（Ascosphaeraapis）引起蜜蜂幼蟲死亡的真菌型傳染?。ㄚw紅霞等，2014）；黃曲霉病又稱結石病或石蜂子病，是一種由黃曲霉菌引起的蜜蜂傳染病。一般4日齡蜜蜂幼蟲極易感染蜜蜂白堊病，且雄蜂幼蟲較工蜂更易感染，患病幼蟲常出現蟲體膨脹特征并長出白色絨毛充滿于整個巢房（Maxfield-Taylor et al.，2015），蟲體多呈六邊形狀，患病后期萎縮干枯、褶皺、變硬發白或呈黑褐色（趙柏林，2007）。蜜蜂幼蟲、蛹和成年蜂均易受黃曲霉病感染，但常見于幼蟲和蛹，該病多發生在夏秋多雨季節；幼蟲和蛹死亡后先呈蒼白色，之后逐漸變干、變硬，表面長滿白色菌絲和黃色帶點綠的孢子（陳曉云，2013a），且充滿巢房，輕微振動則孢子四處飛散；成年蜂染病后，一開始表現不安寧，之后變得虛弱無力，常爬出巢房外死亡。

蜜蜂真菌型疾病頻繁發生，嚴重阻礙了養蜂業的快速發展。目前，針對蜜蜂真菌型疾病的PCR檢測方法也有報道（表2）。蜜蜂白堊病診斷是選擇蜜蜂球囊菌的ITS1、ITS2和5.8S rDNA保守序列（U68313）為靶標，建立TaqMan探針熒光PCR檢測法，其靈敏度為1 ng/μL（宋戰昀等，2010a）。針對黃曲霉菌檢測，可以參考基于alfP基因的巢氏PCR（Nested-PCR），其特異性較高（劉裴清等，2015）。

3 病毒型疾病

病毒型疾病是由蜜蜂病毒引起的傳染性疾病，其病原主要屬于腸道病毒屬和虹彩病毒屬。低濃度的蜜蜂病毒可長期以無明顯發病癥狀的感染方式停留在蜜蜂體內，一旦在特定環境條件下被激發，將會表現出強烈的致病性而引起蜜蜂快速死亡。目前，蜜蜂病毒病主要包括中蜂囊狀幼蟲病、蜜蜂急性麻痹病、蜜蜂慢性麻痹病、蜜蜂克什米爾病毒病、蜜蜂黑蜂王臺病毒病、蜜蜂卷翅病毒病和蜜蜂以色列急性麻痹病毒病等。

近年來，中蜂囊狀幼蟲病在養蜂區經常暴發，嚴重影響了我國中蜂產業的發展。引起囊狀幼蟲病的病原是腸道病毒屬的囊狀幼蟲病毒（Chinese sac brood virus，CSBV），屬于正鏈單股小核糖核酸病毒，對蜂群危害極其嚴重，且中華蜜蜂較西方蜜蜂更易感??；發病初期無明顯癥狀，中期幼蟲背部呈棕色斑點，并逐漸變成暗灰色，皮下滲出液增多且略帶黃色，形似水袋；發病后期，子脾上既有死蛹也有健康蛹，出現“插花子脾”現象（李薇等，2014）。蜜蜂急性麻痹病是由腸道病毒屬的急性蜜蜂麻痹病毒（Acute bee paralysis virus，ABPV）所引起；該病毒主要侵害蜜蜂的神經系統，且在35 ℃下致病性最強；染病的成年工蜂表現出麻痹癥狀，失去飛行能力，離巢后快速死亡。與蜜蜂急性麻痹病不同，蜜蜂慢性麻痹病的病原是慢性蜜蜂麻痹病病毒（Chronic bee paralysis virus，CBPV）。CBPV是一種正鏈單鏈RNA病毒，由兩段長度分別為3647個堿基（RNA1）和2305個堿基（RNA2）的RNA單鏈構成，主要侵襲成年工蜂，感染的蜂群可能同時出現Ⅰ型和Ⅱ型兩種典型的麻痹病癥。Ⅰ型麻痹綜合癥表現為患病蜜蜂身體和雙翅不正常振顫、雙翅常無法閉合，失去飛行能力；Ⅱ型麻痹綜合癥又稱“黑盜蜂”、“脫毛黑蜂癥”或“黑小蜂”等，患病蜜蜂個體初期具備飛行能力，身體絨毛逐漸脫落，體色加深變黑。蜜蜂克什米爾病是由蜜蜂克什米爾病毒（Kashmir bee virus，KBV）引起，目前該病毒已先后在東方蜜蜂和西方蜜蜂體內被發現；感染初期無明顯發病癥狀，一旦有少數病毒顆粒進入蜜蜂淋巴液后，便可在短時間內大量繁殖復制，病毒濃度急劇增加，最終導致染病蜜蜂在3 d內死亡。蜜蜂黑蜂王臺病毒（Black queen cell virus，BQCV）是引起蜜蜂黑蜂王臺病毒病的病原，該病毒已經在歐洲、北美和澳大利亞鑒定出；主要危害蜂王的幼蟲和蛹，春季和初夏為發病高峰期，其典型癥狀為患病幼蟲體色變黃，表皮逐漸硬化成一皮囊；發病蜂蛹體色變暗，快速死亡，甚至王臺內壁被染呈棕色或黑色（張炫等，2012）。蜜蜂卷翅病毒病是由蜜蜂卷翅病毒（Deformed wing virus，DWV）所引起，發病成蜂的雙翅卷曲變皺，身體萎縮，體色變暗，只能爬行，失去飛行能力，羽化后1～2日內死亡（Ribière et al.，2002）。以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus，IAPV）是一種廣泛傳播于蜜蜂群體間的RNA病毒，此病毒可侵染任意發育時期的蜜蜂，蜜蜂感染初期，其腹部、胸部逐漸變黑，既不采食也不飛行，不停地在蜂箱外空地上轉圈，后期胸部絨毛脫落，麻痹、抽搐而死（Maori et al.，2007）；也有研究初步證實，該病毒可能是導致蜂群崩潰失調癥（Colony collapse disorder，CCD）的最大影響因素，因此備受關注。

蜜蜂病毒病屬于暴發性傳染病，因此前期的蜂病監測具有重要意義。至今，針對蜜蜂中蜂囊狀幼蟲病的診斷研究較多，常規RT-PCR和環介導等溫擴增（LAMP）兩種檢測方法均已被推廣應用于CSBV檢測，且對比發現LAMP診斷結果更快速、特異，其檢測最低限度為1 pg（Ma et al.，2011）；基于TaqMan探針的熒光PCR檢測方法也被應用于CSBV檢測，其檢測靈敏度為1.0×102拷貝/μL（宋戰昀等，2010a）。在針對ABPV、CBPV、KBV、BQCV、DWV和IAPV的檢測中，RT-PCR檢測方法已比較成熟，均能特異地擴增獲得靶基因（表3），為蜜蜂病毒病的快速檢測提供了技術支持。

4 寄生蟲類疾病

寄生蟲類疾病是因寄生蟲寄生于蜜蜂宿主而引起的傳染性疾病，主要通過侵染蜜蜂不同部位及攝取蜜蜂體內營養物質而最終導致蜜蜂組織崩潰。目前較常見的寄生蟲病包括蜜蜂微孢子蟲病、阿米巴病和蜂螨病。感染寄生蟲后的蜜蜂均表現出體質衰弱，蜂群發展緩慢，已逐漸成為制約蜂產業發展的主要病害。

蜜蜂微孢子蟲病（Microsporidiosis）又稱蜜蜂微粒子病，其病原為蜜蜂微孢子蟲（Nosemaapis），主要寄生于中腸組織，受感染的蜜蜂因維持穩態和組織更新等相關基因受到嚴重抑制而引發組織崩潰；患病初期無明顯外部癥狀，且飛行正常；患病后期，蜜蜂個體瘦小，反應遲鈍，萎靡不振，兩翅散開不相連，且蟄刺反應喪失，腹部1～3節背板呈深棕色，前胸背板和腹尖變黑，多爬伏在框梁或蜂箱前草地上。阿米巴病是由蜜蜂馬氏管變形蟲（Malipighamoeba mellificae）侵襲成蜂馬氏管所引起的一種傳染病，患病蜂群發展緩慢，群勢逐漸減弱，但在群內及蜂箱周圍很少見到死蜂；病蜂腹部膨大，有時出現下痢癥狀，體質衰弱，無力飛行，不久死亡；取病死蜜蜂鏡檢，發現馬氏管膨大，近似透明狀，且管內充滿珍珠樣的包囊（彭文君等，2014）。螨蟲寄生是蜜蜂最主要的病害之一，目前已發現有7種蜂螨，其中以大蜂螨、小蜂螨及武氏蜂盾螨對養蜂業的危害較大。大蜂螨常寄生于蜂體胸、翅、足基部，感染后蜜蜂蜂體衰弱，采集力下降，壽命減短，成年工蜂煩躁不安，四處亂爬，無法正常飛行；小蜂螨常寄生于幼蟲體內，多在子脾上活動（陳曉云，2013b），感染后蜜蜂幼蟲表皮破裂，呈乳白色或淺黃色，可造成比大蜂螨更嚴重的“爛子”現象（彭文君等，2014）。

為了更好地診斷蜜蜂寄生蟲病，有關學者也在積極尋找更簡便、快速的檢測方法（表4）。對于蜜蜂微孢子蟲病，已針對西方蜜蜂微孢子蟲16S rRNA基因（U26534，GI857487）、小亞基單位核糖體DNA（16S rDNA）及核糖體轉錄間隔區（ITS）基因序列的高度特異區域設計了特異性引物，經PCR擴增可成功獲得特異的DNA片段（何超，2014）。在蜜蜂阿米巴病檢測研究中，環介導等溫擴增方法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）已被報道，是根據阿米巴變形蟲（Entamoeba histolytica）的HYL6基因設計LAMP引物，其檢測靈敏度可達15.8 ng/μL（Rivera and Ong，2013）。

5 展望

在蜂業生產過程中及時檢測并正確區分疾病病原，對有效阻斷病原傳播、保障蜂產品安全具有重要意義。PCR作為新一代的病原檢測技術，是以病原微生物特異、保守的DNA/RNA分子序列為檢測靶標，通過設計特異性引物進行擴增，具有誤差小、方法簡單、操作便捷、特異性強等特點，可針對病原進行一對一地檢測，極大提高了對蜜蜂疾病的診斷效率。由于某些相似病原體間的基因序列具有高度保守性，因此在實際診斷過程中仍然存在缺乏PCR鑒定靶標、PCR檢測假陽性等問題。隨著現代基因與轉錄組高通量測序技術的高速發展，今后應著眼于以下幾點，有效解決蜜蜂疾病快速、特異診斷的障礙：（1）基于已測序的蜜蜂病原體基因與轉錄組數據，通過比較基因組學分析方法，篩選單一病原體的特異候選靶標基因，提高PCR檢測結果的特異性，避免交叉擴增，進而確保診斷結果更準確；（2）設計并優化針對特異基因片段的引物序列，降低引物錯配率，提高PCR擴增結果的準確性和可信性；（3）基于先進的病原檢測方法，如實時定量RT-PCR（qRT-PCR）、TaqMan探針、電化學檢測、LAMP等，建立靈敏度更高的疾病診斷方法；（4）完善LAMP、ELISA、免疫試紙條法等在蜜蜂疾病診斷中的應用，促使蜜蜂疾病診斷更加快速便捷。

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（責任編輯 蘭宗寶）