環介導等溫擴增技術及其在轉基因作物檢測中的應用

易小平　夏啟玉　郭安平

摘 要 轉基因作物及其產品的安全性一直存在著較大的爭議，人們對轉基因產品仍持謹慎態度。因此，快速、準確、靈敏的轉基因檢測手段對轉基因生物的安全監管至關重要。環介導等溫擴增（LAMP）是一種恒溫核酸擴增的技術，其設備簡單、成本低廉、結果可視化，且靈敏度高，現已廣泛應用于細菌、病毒、寄生蟲、轉基因等檢測行業。介紹了LAMP技術的原理、特點和聯合應用其他技術，及其在轉基因作物與產品檢測方面的應用情況。

關鍵詞 環介導等溫擴增；轉基因作物；成分檢測

中圖分類號 Q789 文獻標識碼 A

Abstract The safety of genetically modified crops and their products has always been under controversy； People remain cautious about transgenic products. Therefore， fast， accurate and sensitive detection methods for transgenic ingredients are very important to the safety supervision of genetically modified organisms. Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）is a kind of isothermal nucleic acids amplification technology. Due to its simple equipment， low cost， result visualization and high sensitivity， LAMP has been widely used in detections of bacteria， viruses， parasites， transgenic ingredients， etc. In this paper， we reviewed the principle， characteristics， and combined application with other technology of LAMP and its applications in detection of genetically modified crops and their products.

Key words Loop-mediated isothermal amplification； Genetically modified crops； Ingredient detection

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.030

轉基因是一項新技術，是一個新產業，具有廣闊的發展前景。自1996年轉基因番茄商業化種植以來，全球轉基因作物的種植面積越來越大。國際農業生物技術應用服務組織發布的報告稱，2014年全球轉基因作物總種植面積達1.815億hm2，比2013年增加了630萬hm2[1]。但是，長期以來，人們對轉基因作物及其產品的食用安全和環境安全一直存在爭議。我國于2001年頒布了《農業轉基因生物安全管理條例》，旨在加強農業轉基因生物安全管理。目前我國對轉基因問題的態度，一是確保安全，二是要自主創新。也就是說，在研究上要大膽，在推廣上要慎重。迄今為止，我國只批準了轉基因棉花和木瓜的商業化種植，還未批準任何轉基因主糧的商品化生產。2009年，我國發放了轉基因抗蟲水稻華恢1號和Bt汕優63在湖北省生產應用的安全證書，并于2014年12月11日續簽5年，但仍未批準商業種植。但是，我國出口的米制品中屢次檢出轉基因成分，非法種植銷售轉基因作物的現象也時有發生，因此，我國還需要進一步加強轉基因生物安全的監管工作。

快速和準確的轉基因檢測技術是轉基因安全監管的重要工具。目前轉基因檢測中使用最多的是基于核酸序列的PCR方法。環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種在等溫條件下進行核酸擴增的技術，與常規PCR相比，其設備簡單，特異性好，靈敏度高，結果肉眼可視，因此，很適合于基層或現場快速檢測。該方法已廣泛應用于微生物病原、寄生蟲、轉基因成分等領域的快速檢測[2-3]。本研究介紹了LAMP的原理、特點、聯合應用其他技術及其在轉基因作物與產品檢測中的應用。

1 環介導等溫擴增技術

LAMP是日本榮研株式會社的Notomi等[4]開發的一種新型等溫核酸擴增技術，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60～65 ℃恒溫擴增，30～60 min左右即可完成核酸擴增，擴增時產生大量白色沉淀，用肉眼觀察就能鑒定擴增與否。

LAMP技術需要一對外引物F3與B3和一對內引物FIP與BIP特異性的識別靶序列的6個區域，其中FIP由F1c和F2組成，BIP由B1c和B2組成（圖1）。

LAMP反應在Bst DNA聚合酶的作用下，在60～65 ℃下不停的進行鏈置換DNA合成，達到核酸擴增的目的。LAMP的擴增原理[5]見圖2和圖3，擴增分兩個階段：起始階段和擴增循環與延伸階段，最終形成的擴增產物是有許多環的花椰菜形狀的莖-環結構的DNA。

1.1 特點

LAMP與最常用的PCR技術相比，具有以下幾個特點：（1）設備簡單，反應快速。只需要一臺水浴鍋或恒溫箱即可；30～60 min就可完成擴增反應。（2）擴增效率高?？稍?0～60 min內實現109～1010倍的擴增[6]，靈敏度比普通PCR技術要高2～3個數量級[7-8]。（3）特異性高。LAMP的4條引物特異性的匹配模板上的6個區域，任何一個區域不匹配就無法完成擴增。（4）結果可肉眼觀察。

LAMP也存在一些缺點，如產物檢測是終點檢測，無法區分非特異性擴增和引物二聚體引起的假陽性；LAMP反應開蓋易造成氣溶膠污染。此外，LAMP反應的靶序列最好控制在300 bp以下，大的片段較難擴增。

1.2 產物檢測

1.2.1 瓊脂糖凝膠電泳 電泳檢測可見LAMP擴增產物是大小不等的DNA片段組成，呈現出特異的梯狀條帶。電泳法檢測擴增產物需要特定的儀器設備，耗時長，不能滿足快速檢測的需要。

1.2.2 濁度觀察法 LAMP擴增時產生的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+反應產生大量副產物焦磷酸鎂白色沉淀，因此肉眼觀察即可判斷擴增反應的發生與否：若反應管內液體渾濁，離心或靜置后有白色沉淀則為陽性，否則為陰性。LAMP反應中焦磷酸鎂沉淀的生成量與DNA生成量之間呈線性關系，因此可對起始模板定量，并且焦磷酸鎂沉淀在400 nm處有吸收峰，使得LAMP反應可通過濁度進行實時定量和定性分析[9-10]。濁度法可避免開蓋污染。目前已有商品化恒溫擴增實時濁度儀出售。

1.2.3 顏色觀察法 LAMP反應可通過添加熒光染料后的顏色變化來鑒定擴增與否。常用的有SYBR Green I、鈣黃綠素[11]、羥基萘酚藍（HNB）[12]等。添加SYBR Green I時，若發生了擴增，LAMP反應液由橙色變為綠色。添加鈣黃綠素檢測時，若發生了擴增，反應液由橙色變為綠色，但是加入了Mn2+導致反應靈敏度降低。HNB不需額外添加成分，靈敏度與SYBR Green I相當，發生擴增反應時，反應液由紫色變為天藍色。鈣黃綠素和HNB均可在反應前加入，可避免開蓋污染；但SYBR Green I要在反應結束后才加入，因為顯色需要的SYBR Green I的濃度會抑制擴增反應。有研究者在反應液上覆蓋一層礦物油，再將SYBR Green I點加在管壁或管蓋里，待反應完成后顛倒反應管混勻來觀察顏色變化，也無需開蓋；此外，還有商業化的特制的LAMP反應管。

除了以上終點檢測法外，LAMP還可以利用熒光染料[13-14]、熒光素酶[15]等進行實時定性或定量檢測，目前已有多家公司出售恒溫熒光擴增檢測儀。

1.3 技術改進

Nagamine等[16]通過在F2、F1 之間和B2、B1之間增加上游環狀引物（LF）和下游環狀引物（LB），可使反應時間縮短至30 min，提高了檢測效率。Yano等[17]通過加入環引物的LAMP方法對腸毒素大腸桿菌（ETEC）的熱敏腸毒素LT1及耐熱腸毒素ST1基因進行檢測，擴增反應時間僅需35 min。由于LAMP的引物設計較為復雜，為方便LAMP引物的設計，LAMP 引物設計可由專門的在線引物設計網站完成（http：//primerexplorer.jp/e/）。

LAMP技術是針對DNA進行的檢測，但在反應體系中直接加入反轉錄酶可進行RT-LAMP，用來對RNA病毒進行快速檢測，省去了反轉錄步驟，極大縮短了RNA病毒檢測的時間；RT-LAMP方法中也可以通過加入環引物的方式進一步縮短擴增反應時間，提高檢測效率[18]。

此外，NEB公司開發的新型Bst鏈置換聚合酶（Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase），具有熱啟動活性，而且比普通的Bst酶具有更快的延伸活性，有效的提高了LAMP的擴增效率。

2 LAMP與其他技術的聯合應用

2.1 結合DNA探針技術

LAMP雖然特異性較高，但是其結果觀察還是不能避免非特異性產物引起的假陽性。利用探針標記技術進行LAMP，可以有效避免非特異性擴增引起的假陽性問題。Mori等[19]在LAMP反應體系中加入與模板片段互補的熒光標記的探針，反應完后，再加入陽離子多聚物聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI），PEI與LAMP擴增產物結合，產生PEI-DNA復合物沉淀，在紫外燈下觀察沉淀中擴增產物DNA片段上結合的探針的熒光，可以特異性檢測目的片段。申建維等[20]用多重LAMP同時擴增耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）耐藥基因mecA和fem A，在反應過程中，兩種分子信標熒光探針（FAM和TET）分別與mecA和femA基因的擴增產物互補序列結合，通過檢測反應管中的兩種熒光值來判斷擴增結果，檢測限為10 CFU/mL。Tani等[21]利用alternately binding quenching（AB-Q）探針建立了一種ABC-LAMP技術，快速成功的對氨氧化酶基因amoA基因進行定量分析。除了熒光標記的探針外，納米金標記的探針也很好地應用于LAMP中。Jaroenram等[22]首次將納米金顆粒標記的DNA探針應用于LAMP，用于蝦黃頭癥病毒（yellow head virus，YHV）的鑒定。LAMP產物與納米金標記的探針雜交5 min后，混合物中加入一定濃度的氯化鎂溶液，若無特異性擴增產物，由于鹽的屏蔽效應，納米金顆粒會聚合到一起，使原本紅色的溶液變為藍紫色。此方法還可以用紫外可見光光譜法進行定量分析。該方法還成功應用于對蝦野田村病毒（Penaeus vannamei nodavirus，PvNV）[23]、蝦傳染性肌肉溶解病毒（infectious myonecrosis virus，IMNV）[24]、白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）[25]和對蝦腸孢子蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）[26]的檢測。

2.2 結合橫向流動試紙條技術

Kiatpathomchai等[27]首次將橫向流動試紙條（Lateral flow dipstick，LFD）與LAMP結合，成功建立了對蝦桃拉綜合征病毒（Taura syndrome virus，TSV）的LAMP-LFD檢測技術。在LFD檢測反應中，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產物特異性雜交，并與膠體金標記的抗FITC的抗體結合形成三元復合物，結合在LFD上具有生物素抗體的檢測線上；未雜交的FITC標記探針與膠體金標記的抗FITC的抗體形成不含生物素的兩元復合物，通過檢測線而結合在控制線上，完成顯色和結果判斷。該方法的顯色依賴于探針與目的核酸序列之間的特異性雜交，非特異性擴增無法顯色，解決了終點檢測時無法區分非特異性擴增的問題。Jaroenram等[28]建立了對蝦白斑綜合癥病毒的LAMP-LFD檢測方法，50 min內完成從DNA提取到LFD顯色，靈敏度與巢式PCR相當。Njiru[29]建立了快速靈敏的檢測非洲人類錐蟲?。╤uman African trypanosomiasis，HAT）病原的LAMP-LFD方法。國內也有一些LAMP-LFD的報道，如Wang[30]建立了轉基因大豆Roundup Ready soybean（RRS）的LAMP-LFD檢測方法，檢測限為20拷貝質粒模板，是普通PCR的20倍。董培培等[31]利用LAMP-LFD技術實現了鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）的快速檢測，整個過程可在30 min內完成，檢測限為7.7 CFU/mL。其他研究者也相繼建立了創傷弧菌（Vibrio vulnificus）[32]、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）[33]和單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）[34]的LAMP-LFD檢測方法。LAMP-LFD法檢測條件簡單，特異性顯色目的核酸片段，適用于基層實驗室或現場檢測時使用，目前已有商品化的核酸試紙條出售。

2.3 結合生物芯片技術

生物芯片是通過縮微技術，將生命科學領域中不連續的分析過程集成于芯片表面的微型生物化學分析系統，可以實現從生物化學反應到結果檢測分析的所有功能，具有集成化、自動化、快速高效、高通量等特點。聯合應用芯片技術和LAMP是一個新的研究熱點。國內研究者將LAMP與芯片聯合應用的報道很多。羅磊等[35]研制了一款基于芯片技術的LAMP擴增反應檢測平臺及相應的檢測控制系統，在此LAMP芯片上進行了金葡菌（Staphylococcus aureus）LAMP反應最佳擴增條件的研究。Fang等[36]將LAMP整合于8通道的微流體芯片上，根據反應產生的白色沉淀肉眼即可觀察結果，檢測限為10 fg/μL，將該芯片連接于光學探測器即可定量分析。隨后他們將樣品DNA快速提取也整合于同一塊芯片上，根據綠色熒光肉眼觀察結果[37]。Zhu等[38]研發了一種無需動力裝置的自吸離散式微流控芯片，用于數字LAMP定量檢測。該芯片有4個獨立的面板，每個面板上有1 200個獨立的6 nl的小室，可同時對4個樣本準確定量。Zhou等[39]研發了一種整合了實時熒光LAMP反應的微流體芯片，能同時檢測10種病原細菌。Luo等[40]將LAMP反應整合于激光蝕刻的銦錫氧化物電極的多元微流體芯片，成功的檢測了上呼吸道感染細菌。臺灣也有一些此方面的研究。Wang等[41]將樣品DNA制備和LAMP反應整合于微流體芯片上，利用光度計檢測光學密度可進行半定量分析，采用該芯片檢測MRSA，檢測限約10 fg/μL。Chang等先后研發了檢測水產養殖病原體的微流體芯片系統及檢測新鮮蘭花葉片中病毒的微流體芯片系統，均整合了核酸提取、LAMP及濁度檢測于同一塊芯片上[42-43]。Lin等[44]也研發了整合了病毒RNA純化和RT-LAMP反應及埋式光纖檢測的的微流體芯片系統，用以檢測蘭花病原體。

國外研究者也致力于整合LAMP反應于微流體芯片上。Tourlousse等[45]研發了一種一次性的微流體芯片，可整合實時熒光LAMP反應，利用該芯片20 min內成功的定量檢測了多種病原菌，靈敏度達到10～100拷貝基因組/μL。Stedtfeld等[46]研發了一款整合了LAMP反應的微流體芯片檢測裝置Gene-Z，可同時檢測4個樣本，通過WIFI連接在智能手機上實時監測反應。該裝置商業成本不超過1 000美元，一次性的芯片成本約2～10美元。Sun等[47]研制了整合樣品制備與LAMP反應的多通道的微流控芯片系統，快速實時定量檢測食物樣品中的沙門氏菌（Salmonella spp.）。

2.4 結合生物傳感器技術

生物傳感器，是一種對生物物質（核酸、抗原、酶、細胞等）敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器。目前在食品分析、生物醫學、臨床檢驗、環境檢測等方面有廣泛的應用前景。生物傳感器通常與微流體芯片聯合應用到LAMP技術中，快速高效、集成化、自動化和高通量的檢測擴增產物。Nakamura等[48]利用電化學DNA芯片結合LAMP檢測了6個類風濕性關節炎的SNP多態性。Ahmed等[49]研發了一種利用電化學基因傳感器快速分析LAMP擴增產物的簡易裝置DNA stick（DS），成功的檢測了轉基因玉米CBH 351，檢測限是3×102 拷貝/反應。該裝置分LAMP反應層和含染料與電化學印刷（DEP）芯片的檢測層，中間以混合閥隔開；LAMP反應完后，破壞混合閥混合擴增產物和熒光染料H33258，然后顛倒裝置，使混合物浸入到連接了電化學檢測設備的DEP芯片，通過陽極電流信號的降低來檢測擴增產物。之后他們又利用LAMP結合電化學基因傳感器成功鑒定了食品原料和加工品中肉的種類[50]。Sun等[51]采用基于碳離子液體電極的電化學DNA傳感器結合LAMP技術成功的檢測了豬肉中小腸結腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）。Patterson等[52]整合了LAMP及電化學DNA傳感器于手提式微流體芯片系統上，檢測來源于膿毒癥小鼠的全血樣中的沙門氏菌及血清型種內區分。Zhi等[53]首次制造了新穎的整合LAMP、線性探針雜交法和巨磁電阻傳感器的微流控芯片系統，用于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因分型。Xie等[54]利用電化學適體生物傳感器結合LAMP技術靈敏的檢測赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）。

3 環介導等溫擴增技術在轉基因作物及其產品檢測中的應用

LAMP技術經過十多年的發展，已廣泛地應用在食品[55]、環境[56]、醫學[57]等方面的快速檢測。LAMP在轉基因成分的快速檢測方面的應用也越來越多，如外源基因的檢測及轉化事件檢測，主要作物有玉米、大豆、水稻、油菜等。

3.1 外源基因

CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、NOS終止子、抗蟲基因和抗除草劑基因Cp4-epsps是轉基因植物中使用較多的外源基因，常用于轉基因成分的初步篩選。Fukuta等[58]建立了CaMV35S啟動子的實時濁度LAMP檢測方法，用此方法檢測轉基因大豆Roundup Ready中的CaMV35S啟動子，檢測限為0.5%。熊槐等[59]將LAMP反應液和SYBR Green I在反應前同時置于特殊設計的HF反應管中，實現了閉管檢測，并對轉基因作物中CaMV35S啟動子和NOS終止子進行了檢測。王永等[60]建立了轉基因作物中CaMV35S啟動子的LAMP檢測方法，靈敏度是常規PCR的10倍，并應用該方法對7種轉基因作物進行了CaMV35S啟動子檢測，結果準確。李向麗等[61]建立了食用植物油中的CaMV35S啟動子的實時濁度LAMP檢測方法，靈敏度達0.01%。鄺筱珊等[62]建立了一種檢測食品和飼料中FMV35S啟動子的實時濁度LAMP檢測方法，檢測限為0.5%。蘭青闊等[63]建立了針對轉基因大豆Cp4-epsps基因的LAMP 檢測方法，65 ℃反應30 min即可，檢測限為0.005%。劉彩霞等[64]和袁瑛娜等[65]也分別建立了Cp4-epsps基因的LAMP 檢測方法，檢測限為0.01%。周琳華等[66]建立了cry1Ab抗蟲基因LAMP檢測方法，以質粒為模板時靈敏度達20拷貝/μL。對市售的玉米面、玉米粉、甜玉米、米粉等進行LAMP檢測，結果與SYBR Green I熒光PCR法一致。Li等[67]也建立了cry1Ab基因的LAMP檢測方法。其他研究者也建立了cry1Ac、cry2Ab和cry3A的LAMP檢測方法[68-69]。Randhawa等[70]建立了啟動子（CaMV35S和FMV35S啟動子）和標記基因（aadA、nptII和uidA）的實時熒光LAMP檢測方法，最低檢測到4拷貝基因組DNA。Feng等[71]建立了7種外源基因（CaMV35S啟動子、NOS終止子、NPTII、PAT、Bar、FMV35S啟動子和Gox）的LAMP檢測方法，均能檢測到0.5%的轉基因產品。此外，抗除草劑pat基因[72]、轉基因玉米LY038外源cordapA基因[73]及轉基因玉米BVLA430101植酸酶（phytase）基因[74]也均建立了相應的LAMP檢測方法。

3.2 品系檢測

我國已經獲得安全應用的生產證書的作物有轉植酸酶基因玉米BVLA430101、水稻（華恢1號和Bt汕優63）和棉花，獲得進口安全證書的有棉花、大豆、玉米、油菜4種轉基因作物用于加工原料。在通過外源基因檢測初步篩查出含轉基因成分的作物或加工品后，有必要對其所含轉基因品系進一步檢測。

3.2.1 玉米 目前我國進口的轉基因玉米主要用于飼料加工，LAMP方法在轉基因玉米品系的快速檢測方面的應用很多。Chen等[75]建立了7種轉基因玉米（DAS-59122-7，T25，BT176，TC1507，MON810，BT11和MON863）的LAMP 快速檢測方法，采用SYBR Green I染色，檢測時間在40 min內，除MON810的檢測限是40拷貝基因組DNA外，其他6種轉基因玉米的檢測限均為4 拷貝基因組DNA。蘭青闊等[76]建立了轉基因玉米MON863的LAMP檢測方法，檢測限為0.01%；Huang等[77]也建立了MON863的熒光定性和定量LAMP 檢測方法，檢測限為4拷貝基因組DNA。張雋等[78]建立了轉基因玉米MON89034的LAMP實時濁度檢測方法，靈敏度達1 pg。凌莉等[79]建立了轉基因玉米MIR604的LAMP實時濁度檢測方法，檢測限為0.5%，特異性和穩定性均達到100%。王小玉等[80]建立了轉基因玉米MON810的LAMP實時濁度檢測方法，檢測限為0.5%。此外，其他研究者也建立了轉基因玉米Bt11[81-82]、Bt176[83]、T25[84]、GA21[85]品系的LAMP檢測方法。

3.2.2 大豆 中國每年都進口大量轉基因大豆用于食用油及其他豆制品的加工原料，因此轉基因大豆的快速靈敏的檢測方法必不可少。Guan等[86]根據轉基因大豆GTS40-3-2和MON89788的3′端轉化體特異性序列分別設計LAMP引物，建立了GTS40-3-2和MON89788品系的LAMP檢測方法，采用熒光染料染色，40 min內完成檢測，檢測限均為0.005%。劉津等[87]也根據GTS40-3-2的3′端轉化體特異性序列設計LAMP引物，利用實時濁度儀對反應體系和條件進行優化，建立了GTS40-3-2品系的LAMP檢測方法，檢測限為0.5%。王永等[88]則根據GTS40-3-2的5′端轉化體特異性序列設計LAMP引物，建立了GTS40-3-2 轉化體特異性成分的LAMP檢測方法，利用鈣黃綠素染料觀察結果，檢測限為0.001%，是普通PCR方法的10倍。蔡穎等[89]和邵碧英等[90]分別建立了轉基因大豆A5547-127和A2704-12品系的LAMP 檢測方法，檢測限均達到0.1%。

3.2.3 水稻 我國尚未批準轉基因水稻的生產許可，但市面上及出口大米卻屢次檢出含轉基因成分。為了加強轉基因水稻的種植管理及種子非法生產銷售的監管，建立快速靈敏的轉基因水稻檢測方法至關重要，目前針對轉基因水稻華恢1號和Bt63品系的LAMP檢測方法均有報道。Chen等[91]建立了3種轉Bt水稻（KMD1，TT51-1和KF6）的LAMP檢測方法，分別采用兩種染料SYBR Green I和HNB染色及凝膠電泳觀察反應結果，KMD1和TT51-1的檢測限為0.01%，KF6的檢測限為0.005%，靈敏度較普通PCR高10～100倍。吳少云等[92]建立了轉基因水稻Bt63品系的實時濁度LAMP檢測方法，檢測限為0.01%；用該方法對市面上的24份大米樣品進行Bt63品系成分檢測，檢出2份陽性，與熒光PCR檢測結果完全一致。張明哲等[93]也建立了轉基因水稻Bt63品系的LAMP檢測方法，靈敏度均達0.01%。Chen等[94]建立了轉基因水稻TT51-1的LAMP可視化檢測方法，檢測限為20拷貝基因組DNA，比傳統PCR靈敏10倍。

3.2.4 其他 除了玉米、水稻和大豆等作物外，還有一些其他轉基因植物也建立了相應的LAMP檢測方法。Rostamkhani等[95]用LAMP法快速鑒定了轉基因棉花中的chitinase（chi）and cry1A（b）基因，與傳統PCR法進行了比較，LAMP法的檢測限為稀釋至10-8的模板DNA，為傳統PCR的100倍。Zhou等[96]建立了轉基因甘蔗中cry1Ac基因的LAMP檢測方法，檢測限為43.1拷貝質粒，1.0 ng/μL甘蔗基因組DNA。Cheng等[97]建立了轉基因小麥B73-6-1的LAMP檢測方法，38 min內完成擴增，靈敏度為0.1%，相當于6拷貝小麥基因組DNA。劉二龍等建立了轉基因苜蓿草J163品系和J101品系的LAMP檢測方法，檢測限為16 pg，相當于10 拷貝苜蓿草基因組DNA[98-99]。

4 展望

雖然LAMP技術反應快速，設備簡單，結果肉眼可見；但是，植物基因組DNA的提取仍需要昂貴的高速離心機等儀器，耗時也較長，這直接影響了LAMP技術在田間或基層檢測的推廣應用。Kaneko等[100]發現LAMP對MEM培養基和幾種生物制品（鹽、PBS、血清、血漿等）具有較強的耐受性。因此，可以開發更簡單、經濟、快速的DNA提取方法，進一步縮短檢測時間，使LAMP技術更適合在田間或基層檢測的應用。Zhang等[101]開發了一種新穎的適用于田間快速篩選和常規實驗室診斷的轉基因檢測系統。該檢測系統由一個DNA提取裝置結合改良的可視化LAMP技術來進行轉基因的檢測。DNA提取裝置主要含有一個硅膠膜過濾柱和改良的注射器，操作簡單，無需實驗室儀器設備，可用于田間現場檢測。利用該裝置15 min內就能從植物組織提取出高質量的基因組DNA，利用該系統成功的檢測了多種轉基因作物。

此外，LAMP法的終點觀察結果不能排除非特異性擴增，因此將LAMP結合橫向流動試紙條技術可以很好的解決這個問題，試紙條法可以特異性指示目的擴增條帶，簡單快速，適合于田間現場檢測。

LAMP 技術無需專用儀器，僅需水浴鍋或加熱塊，成本低，耗時僅30～60 min，結果判定簡單，特異性好，重復性好，靈敏度高，無需經過專業培訓，尤其適合基層檢驗檢疫機構，或現場快速篩查，是一項可以普及推廣的檢測技術。隨著各種商品化專用儀器及試劑盒的出現，LAMP的操作越發簡單化，如電池驅動的恒溫熒光擴增儀器，僅重1 kg，可以實時觀測擴增結果，非常適合田間現場檢測。2014年我國頒布了轉基因玉米、水稻、大豆及油菜的多個品系的LAMP檢測行業標準，意味著LAMP技術在我國正式應用到轉基因作物的檢測中，未來LAMP技術在轉基因作物及其產品的檢測方面將有良好的應用前景。

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責任編輯：沈德發